實驗動物黑斑模型的建立及其研究

丁克祥　陳華東　趙莉　何曉賓 羅斌　黃冰　梁碧麗

丁克祥，男，1958年生，第三軍醫大學海軍醫學院畢業，現任海軍廣州中心醫院副院長、海軍抗衰老研究中心主任，中山醫科大學、第二軍醫大學碩士研究生導師，本刊編委，《中國老年學雜志》等8家學術期刊副主編、編委，發表學術論文一百多篇，專著7部參編2部，獲軍隊科技進步獎18項(1等1項，2等6項，3等8項，4等3項)

摘要目的：為幫助臨床和美容科研人員尋找祛斑藥物和治療的實驗對象。方法：采用微量定點注射法將黑斑形成液注入動物皮下不同深度，并輔用紫外線照射法。結果：受試動物皮下可形成肉眼可見的黑斑，通過皮膚組織切片染色并用光鏡和透射電鏡觀察，黑斑形成處皮膚組織細胞學結構與正常對照組有明顯區別。結論：實驗動物黑斑模型的建立，對推動美容醫學色素性皮膚疾病的研究和治療具有積極意義。

關鍵詞黑斑模型實驗動物皮膚

STUDY NO THE FOUNDATION OF BLACK SPOTS MODES

IN EXPERIMENTAL ANIMAL

Guangzhou Naval Central Hospital(Guangzhou,510318)

Ding KexiangChen HuadongZhao Li et al

AbstractObjective:To look for a brug ang a therapy method of cleaning spots inlevel of preclinical medicine. Methods:Toadopt methods of micro-fixed-point injection and ultraviolet radiation,We inject formatixe liquid of biack spots into varying depth subcutaneous layer of animal. Results:Visible black spots come into being in subcutaneous layer of experimental animal.There is notable difference in skin histiocytic structure between tsst of skin becoming black spots and control group,by way of skin tissue slice staining and observatiopn with optical and transmission electron microscope.Conclusion: The black spots model in experimentalanimal may be founded under rigid experimental circumstances It will promote the study on pigmentary diseases in medical cosmetology.

Key wiordsBlack spotsModelExperimental animlSkin

皮膚代謝性色素沉著系單純性基底細胞層黑色素增多，是臨床美容皮膚科常見的皮膚疾病。其種類和表現因其病因機制不同而不定，有些發病機制尚不清楚⁽¹⁾。由于皮膚黑斑影響美容，嚴重時也影響皮膚的正常結構和功能，因此，人們希望在祛斑上尋找一些更加快速和有效的治療藥物和方法⁽²⁾。為了避免或減少新的祛斑藥物和治療方法對人體的損傷和副作用、探索藥物最佳的劑量彩奔湫вΓ同時也為了對皮膚色素沉著形成的病因機制作進一步深入研究，實驗動物是非常必要的。我們采用幼年家豬作為實驗動物并建立了實驗動物黑斑模型，現將實驗報告如下。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物幼年家豬，2頭，年齡80天～90天，體重20kg～22kg,雌雄各半，由中山醫科大學實驗動物中心提供。經一周檢疫后即投入實驗。

1.1.2受試器材全套特制微型注射器、精密游標卡尺、特制黑斑定位板及其它手術器械。

1.1.3儀器設備紫外線燈、切片機、蠟封機、顯微鏡、透射電鏡及其配套設備等。

1.1.4制劑黑斑形成液、切片染色液、麻醉劑、生理鹽水等。

1.2實驗方法

1.2.1實驗準備先將動物用水沖洗干凈，用3%戊巴比妥和4.3%水合三氯乙醛麻醉劑，按1ml/kg體重劑量進行腹腔注射。為了保證麻醉效果，本實驗兩種麻醉劑交叉使用。動物被麻醉后迅速抬上手術臺固位、剪毛、再清洗和消毒。

1.2.2實驗方法采用特制黑斑定位板固定在動物已備皮處，用碘酒-酒精消毒后，將已配制好的黑斑形成液充分混勻后抽入特制無菌微型注射器中，并按設計要求分別換上不同規格的特制針頭，依次進行皮下注射，記錄注射時間，并作好標記。以后每天1次用黑斑形成液輕輕點擦外部相應處并每天用紫外線燈照射，連續60天。對照組除用生理鹽水代替黑斑形成液外，其它方法類同。實驗期間，動物保持正常飼養的最適條件，并防止環境污染。

1.2.3切片染色及光鏡、電鏡檢查法分別取豬背部的對照皮膚和黑斑形成處皮膚進行切片、染色，并用光鏡和電鏡參照參考文獻進行^(3,4)觀察。

2結果

2.1肉眼觀察結果黑斑形成液皮下注射的深淺對黑斑的形成有一定的影響。注射初期，注射部位可見黑斑形成液本身的顏色，且顏色因注射深淺略有差異。一周后，黑斑形成液的本色逐漸變淡，有些被皮下注射造成的創面痂皮掩蓋，黑斑難辨。兩周后創面痂皮脫落，暴露新生皮膚。30天后，淺表開始出現黑斑印跡，黑斑雖有些模糊不清，但已隱約可見，特別是皮下1.5mm～2.5mm處，黑斑形成較為清晰明顯，形成類似雀斑形狀和大小的黑斑斑點，隨著時間的延長，至實驗結束時斑點更加明顯、清晰。

2.2光鏡和電鏡觀察結果表明，經黑斑形成液皮下注射并在紫外線作用下所形成的黑斑皮膚表皮基底細胞層，其黑色素細胞產生的黑色素顆粒較正常對照組明顯增多，光鏡檢查經Masson-Fontana黑色素染色的切片發現，表皮各層細胞內，特別是基底細胞層和棘細胞層內黑色素顆粒也較對照組明顯增多，且這些表皮層細胞內黑色素顆粒也較正常皮膚增多；真皮淺層與表皮深層交接處的乳頭狀邊接處也有程度不同的黑色素顆粒，與正常組對照比較，分布明顯密集，散在范圍也明顯擴大。

電鏡檢查，表皮角質層內的殘存橋粒以及棘細胞和基底細胞內的線粒體、內質網的變性程度較正常對照組明顯增多和加重，黑色素細胞結構完整，增生較正常對照組明顯活躍，無橋粒及胞漿內無張力絲，胞體增大，突起增多，胞漿內可見到增加的黑色素及黑色素小體，黑素顆粒也較正常對照組明顯增多。進一步觀察還發現，黑斑形成處皮膚基層細胞層的黑色素細胞較正常對照組明顯活躍，數目增加，多巴陽性反應持久，甚至發現個別較大的黑色素細胞和較多樹狀突起的黑色素細胞。

3結論

3.1動物黑斑模型是色斑，特別是雀斑治療和研究的實驗模型。雖然動物模型的黑斑與人體雀斑病因學和發生機制完全不同，出現的條件和影響因素也有很大差異，但動物模型所形成的黑斑與雀斑在外部形狀、大小以及內部組織學結構及色素改變都比較相似。作者曾通過對動物模型黑斑的外部形態和內部結構與比較典型的雀斑進行對比，并通過病理切片、染色、鏡檢，也得出比較相似結論，因此，可以用此黑斑的動物模型進行雀斑的治療和研究。

本實驗模型采用幼年家豬其皮膚的結構、功能、代謝特征、甚至血管分布、皮膚微循環等生理學和組織學指標均與人類皮膚極其相似⁽⁵⁾，但皮膚表皮基底細胞層中的黑素細胞的功能與人類略有差異，特別是人類雀斑的形成主要由顯性遺傳誘發色素代謝紊亂所致，并受內分泌、藥物、季節、日光、心理等多種因素影響，而動物黑斑則完全依賴黑斑形成液和紫外光等外源性因素誘導產生，且動物所處的實驗環境已基本不受雀斑形成因素的影響，因此尚不能完全將實驗動物黑斑模型與雀斑等同看待。

3.2關于動物皮膚黑斑形成的作用機制可能與黑斑形成液中的有關成分和紫外光輔助照射密切相關。黑斑形成液中含有制斑素、內皮素、黑素細胞和酪氨酸酶激活劑及其相關制劑等，這對剌激和促進黑素細胞的分裂、增殖以及多巴陽性反應活性，加快黑素顆粒的形成和色素沉積有一定的作用^(6,8)，加上紫外光照射及被紫外光激活或促進的黑斑形成制劑的介導，使黑素細胞和黑素反應進一步加強，表皮基底細胞層黑色素進一步積累、沉著、黑斑形成更加明顯^(9,10)。

本實驗也證實黑斑形成與黑素細胞增殖，特別是黑素細胞功能和作為色素沉著決定因子的酪氨酸酶的活性和反應增強有關^(11,12)。但黑斑形成液中相關成分如何促進黑素細胞增殖，提高黑素細胞功能以及這些成分的最佳比例對黑斑形成的時效擦啃Ч叵擔黑斑形成后的維持時間及其代謝變化規律尚有待于在今后的實驗中進一步研究和完善。參考文獻

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