光鑷拉曼光譜在南極細菌低溫降解石油烴中的應用

鄭　洲　繆錦來

摘要光鑷拉曼光譜技術（LTRS）是將光學囚禁技術與顯微拉曼光譜技術相結合，用同一束光來實現囚禁單個懸浮細胞并激發細胞分子的拉曼光譜。利用LTRS系統，可以實現對單個南極石油烴降解嗜冷菌細胞內的生化代謝過程的實時監測，了解其參與石油烴分解代謝的過程，獲知單個細胞內部生化分子變化與環境變化的相互關系，更好的了解其降解機制。

關鍵詞光鑷拉曼光譜技術；南極細菌；石油烴；低溫降解

中圖分類號X55文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2009）04-0263-02

1光鑷拉曼光譜技術特點

激光拉曼光譜法被公認為是研究生物大分子結構、動力學和功能的有效方法，是生命科學研究領域很有應用潛力的工具。從拉曼光譜特征峰的位置、強度和線寬可以獲得樣品的分子組成及結構信息，拉曼光譜已成為研究物質分子結構的有效手段。共焦顯微拉曼光譜技術可以研究單個細胞甚至細胞器，但由于人為的用物理或化學手段固定研究對象，細胞周圍的環境發生改變，甚至細胞死亡，對細胞的生理帶來了未知的影響。最近，光鑷拉曼光譜技術（laser-tweezers-Raman-spectroscopy，LTRS）的出現，使人們可以在接近自然的生理狀態下研究單個懸浮細胞或細胞器[1，2]。LTRS是將光學囚禁技術與顯微拉曼光譜技術相結合，用同一束光來實現囚禁單個懸浮細胞并激發細胞分子的拉曼光譜，其原理是利用高度匯聚的激光束產生的梯度力囚禁溶液中的活細胞，使之固定在激光微束中，再通過瞬時增強的光束來激發細胞內分子的拉曼光譜，從而實時獲得該細胞的拉曼光譜及其生化性質。由于細胞被囚禁在光束焦點位置，共焦光路優化了散射光的收集，從而可獲得高靈敏度。選用適當的激光波長、功率和激發時間，激光束不會傷害細胞，被囚禁的細胞依然懸浮在不受干擾的環境中，得到的是接近自然生理狀態的單個活細胞的拉曼光譜。

2LTRS在單細胞中的應用情況

光鑷拉曼光譜技術可以在接近自然的生理狀態下研究單個細胞或細胞器，探索接近生理狀態下的單細胞生命活動，可以無損地提供豐富的分子結構和物質成分的信息，是一種很有應用潛力的工具，正在生命科學研究領域廣泛應用。目前，光鑷拉曼光譜技術已用于研究溶液中單個活體的紅細胞、細菌和酵母等，得到不同細胞的高質量的拉曼光譜，使得研究溶液中的單個活細胞的生化性質成為可能。Tang等[2]利用光鑷拉曼光譜技術研究了火炬松轉基因細胞系的單細胞拉曼光譜特征。LTRS系統可以成為區別癌細胞與正常細胞的有效手段。楊文沛等[3]利用LTRS系統測量了單個肝癌細胞的拉曼光譜，并利用多元統計分析方法對光譜進行分析，從而建立一個識別正常細胞和癌細胞的數學模型，表征了單個肝癌細胞與正常細胞的差異。岳糧躍等[4]利用LTRS系統對紅細胞凍存前后的變化，以及對紅細胞被解凍后在不同溶液中的變化情況進行了拉曼光譜研究。王桂文等[5]研究表明，LTRS 系統可以研究單個血小板細胞的拉曼光譜，并可以區分不同物種的血小板，是研究溶液中接近自然生理狀態下小生物體、細胞的有力工具，為進一步研究血小板的生理生化反應提供了良好的實驗基礎。王桂文等[6]采用LTRS系統，在水溶液中直接俘獲單個伴孢晶體，并收集其拉曼光譜信號，得到群體伴孢晶體的分子結構和群體內各晶體蛋白之間的信息。該方法免去了復雜的純化過程，為Bt伴孢晶體蛋白的研究提供了一種快速簡便、可以洞悉群體內單個晶體蛋白結構差異的手段。王桂文等[7]利用LTRS系統觀察活性干酵母單細胞活化過程，記錄了干酵母單細胞的生長現象，既可實時觀察單個細胞活化過程的光譜變化，又可獲知細胞間的差異。

3LTRS在南極細菌低溫降解石油烴中的應用

極地石油污染已成為一個普遍而嚴重的問題。在最近十幾年里，人類在極地的活動日益頻繁，大量的柴油、潤滑油和原油進入海水中，人為給極地海洋造成了烴污染，石油烴已經成為極地海洋生態系統中的主要污染物。由于極地海洋常年處于低溫狀態，短鏈石油烴蒸發緩慢，長鏈烴凝為固體，使有機污染物持久存在，對當地生物資源及生態環境的危害很大。因此，對低溫環境下石油烴降解的研究十分重要，而生物降解以其高效、安全日益受到人們的重視。

微生物群落對石油烴的生物降解是清除污染物的一個主要機制。南極嗜冷菌在低溫海洋環境中可以高效降解石油，當南極生態系統被石油烴污染后，能降解石油烴的土著微生物便開始迅速生長，以適應被污染的環境[8]。環境因素和生物因素決定了石油烴生物降解的速率和程度。在極地海洋生態系統中，石油烴的降解涉及到的主要環境因素是溫度。溫度影響石油烴的物理性質和化學組分、微生物的代謝速率和微生物群落組成，間接對烴的降解速率產生影響，研究表明南極細菌在20℃對石油烴的降解率高于4℃。然而，低溫時細菌對石油烴的降解雖然緩慢，但是經過一段時間后，降解率與常溫下并無區別，這表明低溫僅僅延遲了降解時間，并不影響最終的降解率[9]。迄今，已發現的南極烷烴低溫降解菌較少，對其研究也均以菌株的鑒定、催化反應和降解組分分析為主[10]。對烷烴低溫降解過程中南極菌單個細胞的內部生化分子變化及其參與烷烴代謝的機制還不清楚，這些基本問題都亟需研究。

拉曼光譜為獲知單個細胞內部生化分子變化與環境變化的相互關系提供了有力的工具，從拉曼光譜的特征峰的位置、強度和線寬可以獲得樣品的分子組成及結構信息。近年來，已有學者用拉曼光譜技術對南極微生物細胞的實地生命活命活動進行研究，鑒定了一些化合物，并探明其在微生物適應南極極端環境中的作用和機制[11]，這些對南極微生物細胞生命活動的認識通常都是通過研究其群體樣品而得到的統計平均信息，不能探索接近生理狀態下的單細胞生命活動。而LTRS技術可以在接近其自然的生理狀態下研究單個細胞或細胞器，可以實時觀察單個細胞或細胞器的生物化學過程，或判別不同類型、不同狀態的細胞，獲知很多掩蓋在群體平均信息下的個體生命信息。細胞處于溶液中，其生理活性不受影響，可以實現長時間對同一個細胞進行監測。將LTRS技術應用于石油烴微生物低溫降解的研究，可以了解石油烴低溫降解過程中單個南極細菌細胞如何協調能量、細胞生長與烷烴降解三者的關系，從單個細胞水平獲得對南極細菌低溫降解石油烴的新認識，獲知單個細胞內部生化分子變化與環境變化的相互關系；可以實時監測單個南極細菌細胞低溫降解石油烴的動態過程，并可以結合光鑷進行細胞分選；還可以同時記錄石油烴低溫降解過程胞內、胞外的實時石油烴濃度，這是其他方法無法實現的。因此，應用單細胞激光鑷子拉曼光譜技術研究石油烴微生物的低溫降解，可以更好的了解其降解機制，這對低溫海洋環境中石油污染物的消除和環境修復具有重要意義。

4參考文獻

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[7] 王桂文，姚輝璐，彭立新，等.一種酵母細胞生長現象的實時單細胞拉曼光譜觀察[J].微生物學通報，2007，34（6）：1109-1113.

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