花生內轉錄間隔區(ITS)的擴增及序列分析

楊 森

摘要設計1對特異引物,以花生栽培種四粒紅及其與野生種光葉花生的種間雜種為材料,對花生ITS1-5.8S-ITS2序列進行高保真PCR擴增,獲得長度約800bp的單一條帶,在對PCR產物進行克隆測序的基礎上構建了花生屬進化樹。

關鍵詞花生;內轉錄間隔區(ITS)序列;PCR;進化樹

中圖分類號Q789文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)08-0103-02

內轉錄間隔區序列(ITS)廣泛應用于被子植物系統進化研究,為禾本科、大豆屬、棉屬等植物的系統進化研究提供了寶貴的分子遺傳學依據?；ㄉ鷕DNA有關研究報道較少,盡管有分離 rDNA ITS的報道,但未在此基礎上進行花生屬植物的系統發育分析。本研究對花生ITS序列進行分離、測序,并將其與GenBank中登錄的花生ITS序列進行比較和分析,為花生的系統演化及花生的分類鑒定提供分子水平的證據。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用花生為栽培種四粒紅(Silihong)及四粒紅與野生種光葉花生的雜交后代(Silihong×Arachis glabrata Benth.)高世代材料?；ㄉN子取自山東省花生研究所萊西試驗站。

根據Bhagwat等報道的ITS序列,使用軟件DNAS-TAR.Lasergene.v7.1設計1對特異引物:

ITS1&2-1∶5-GTCGATGCCGCACAAACCAGGATT-3

ITS1&2-2∶5-CGGGCACAACGGGGCTCTCA-3

這對引物的擴增區包含ITS1、5.8S和ITS2完整區域。引物由上海英俊生物技術有限公司合成。

1.2方法

取3~5?；ㄉ闯墒斓娜~片置于1.5mL離心管中,加40μL 0.25mol/L NaOH,用1mL槍頭套一PCR管將葉片搗碎,煮沸30s,加160μL含PVP-40的Tris-HCl(pH值7.6),煮沸2min,10 000rpm離心5min,取上清液4℃保存,用時取1μL作模板。取1-1D4-1、1-4D4-1、四粒紅各品種未成熟葉片按上述步驟作簡單處理,依次編號為1、2、3作為PCR模板。

PCR程序為:94℃ 5min,(94℃ 1min,52.1℃ 1min,72℃ 1.5min)30個循環,72℃ 10min。先用Takara Taq DNA聚合酶作PCR,確定有預期分子量大小的條帶后再用高保真Pfu DNA聚合酶擴增,切膠回收DNA,連接轉化后挑取陽性克隆測序。利用DNASTAR.Lasergene.v7.1進行多序列比對。

用Mega4.0軟件以擬南芥核rDNA序列為外群組(outgroup),采用3種方法(NJ、ME、MP)構建進化樹,并進行bootstrap analysis 1 000檢驗[2]。

2結果與分析

2.1ITS區序列的PCR擴增

以總DNA為模版,利用所設計的 2條引物PCR擴增出ITS區的特異性條帶,分子量在800bp左右(圖1),與GenBank所登錄的ITS序列片段長度相近。用Taq DNA Pol PCR體系和pfu DNA Pol PCR體系所擴增出的ITS區序列片段電泳遷移率相同。

2.2ITS1-5.8S-ITS2序列測定與多序列比對

四粒紅與野生種光葉雜交后代擴增產物6份穿刺培養物測序得到3條有差異的條帶,分別命名為1-1、1-2、1-4。四粒紅擴增產物測序后得到的序列命名為3-3。

通過比對發現4條序列在ITS1-5.8S-ITS2區共有單核苷酸多態性位點14個,其中6個位于ITS1區,2個位于5.8S rDNA中,6個位于ITS2區,其他植物上的研究認為5.8S rDNA在進化上相當保守,而ITS1和ITS2則變化很大,本試驗結果與這一結論一致。

2.3花生屬進化樹構建

通過NJ、ME和MP法構建花生屬進化樹,其拓撲結構大致相似,但也有所區別?？傮w看來,各個區組的材料分別聚集到一起,與基于傳統形態學特征的花生屬區組劃分基本一致。從本研究所構建的3棵進化樹來看,圍脈(Ex)區組、三籽粒(Tris)區組、大根(C)區組在花生屬中是比較原始的,花生區組(A)進化程度較高;Gregory等根據花生屬種間可交配性提出圍脈(Ex)區組、直立(Er)區組和根莖(R)區組原根莖系較原始,而花生(A)區組、三籽粒(Tris)區組、大根(C)區組、異形花(H)區組、匍匐(P)區組以及根莖(R)區組真根莖系進化程度較高。

研究結果表明,圍脈(Ex)區組、三籽粒(Tris)區組和異形花(H)區組親緣關系較近;直立(Er)區組和三葉(Trie)區組關系密切,兩者與匍匐(P)區組形成一大的分支。

在本研究構建進化樹所涉及的花生材料當中,有3個未命名的種,其區組歸屬尚不明確,但從所構建的進化樹上看,A.sp.DAP-2004-1、A.sp.DAP-2004-2應屬于花生(A)區組,A.sp.DAP-2004-3可能屬于直立(Er)區組或匍匐(P)區組。

本研究所得4條序列均與花生區組的序列聚為一類,其中1-1、1-4與四粒紅(3-3)關系相近,而1-2與其關系較遠,說明種間雜種既與母本有相似的地方,也與母本有一定的差異,為雜種的真實性提供了分子水平證據。

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