基于DNA染料EMA的PCR技術檢測鑒別副溶血性弧菌死活細胞*

祝儒剛，呂淑霞，劉月萍，張喆

1(沈陽農業大學食品科學院，遼寧沈陽，110866)2(沈陽農業大學生物科學技術學院，遼寧沈陽，110866)3(遼寧大學輕型產業學院，遼寧沈陽，110036)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是海洋和鹽湖中分布的一種嗜鹽性病原菌。分布在近海岸的海水、海底沉積物、魚類、貝類中，適應于高濃度(6%)食鹽的環境中生長。該菌是亞于霍亂弧菌的一種常見腸道致病菌，其污染會給海水養殖業帶來嚴重損失，還會引起人類腹瀉等腸道疾病及食物中毒，出現腹瀉、腹部痙攣、惡心、嘔吐和頭痛等癥狀。自2001年以來，副溶血弧菌性食物中毒爆發已經成為中國最常見的食源性疾患［1－4］。

隨著人們對食品安全性要求的不斷提高，PCR技術以其特異性強、靈敏度高和快速準確等優點已經成為檢測海產品中副溶血弧菌的最主要手段［5－6］。然而，此法的缺點是不能區分所檢測到的副溶血弧菌是活細胞還是死細胞。近年來，人們嘗試各種方法通過PCR技術僅僅檢測樣品中的活菌，例如mRNA的檢測，以及利用能夠與核酸共價結合的染料，這種染料能夠選擇性地滲透到死細胞內部與細胞內的DNA共價結合。在所有這些方法中，一種DNA插入型染料EMA(ethidium bromide monoazide)，展現出了很大的應用潛力，能夠克服所面臨的困難。許多研究表明，EMA與PCR技術相結合，能夠成功地選擇性抑制樣品中死細胞的DNA擴增，以便于更加精確地檢測樣品中活菌細胞的存在［7－10］。

EMA是一種熒光插入型的核酸結合染料，這種染料最顯著的特點是當樣品中死活細胞共同存在時，它能夠選擇性地與死細胞DNA共價結合。由于活菌細胞的細胞膜比較完整，EMA不能滲透到活菌細胞內部。然而，由于通常死細胞的細胞膜已經遭到破壞，EMA很容易滲透到細胞內部從而插入到細胞內DNA雙螺旋上。在經過高強度的可見光曝光處理后，插入到DNA雙螺旋上的EMA能夠與DNA雙螺旋發生共價交叉偶合作用，從而導致死細胞內部的DNA在接下來的PCR擴增過程中被抑制［11－12］。

本研究將EMA選擇滲透性和PCR特異性和靈敏性相結合，從而建立一種快速、靈敏并能夠有效檢測和定量純培養條件下副溶血弧菌死活細胞混合液中的活細胞的新方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

實驗用標準菌株，副溶血弧菌ATCC17802，本實驗室保存。

1.2 儀器與設備

PCR儀(TC-512)，紫外可見分光光度計(752N)，鹵鎢燈(500W)，BIO-RAD凝膠成像儀。

1.3 試劑及培養基

EMA(ethidium bromide monoazide，美國 Sigma公司)，胰胨肉湯(蛋白胨2%，NaCl 4%，0.01%的結晶紫0.5%，pH值9.0)。

1.4 副溶血弧菌熱致死時間確定

取37℃、150 r/min條件下過夜培養的副溶血弧菌菌懸液10 mL，10 000r/min離心10 min。菌體沉淀懸浮于10 mL 0.85%的生理鹽水中，10 000 r/min離心10 min。菌體沉淀再懸浮在10 mL 0.85%的生理鹽水中，再次 10 000 r/min離心 10 min。測定OD600nm并進行平板計數。

取0.5 mL上述菌懸液調整其濃度為2×108CFU/mL至1.5 mL離心管中，95℃水浴加熱，每隔30 s取樣涂平板，37℃過夜培養。

1.5 最佳曝光時間確定

用ddH2O配制0.1 mg/mL的EMA溶液，－20℃避光保存(EMA為致癌物質，注意操作安全)。分別取0.5 mL熱致死副溶血弧菌菌懸液(2×108CFU/mL)于7個小離心管，加入EMA使每管EMA終濃度達到1.4 μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置5 min。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16 cm，分別曝光 0、1、3、5、10、15 和 20 min。同樣方法取活菌菌懸液作為對照。

1.6 不抑制活細胞PCR擴增的最大EMA濃度確定

取EMA溶液(1 mg/mL)分別加入裝有0.5 mL活細胞的副溶血弧菌菌懸液(2×108CFU/mL)的7支離心管中，使 EMA終濃度分別達到0 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL 和 12 μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5 min。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16 cm，曝光20 min。

1.7 完全抑制死細胞PCR擴增的最小EMA濃度確定

將EMA(0.1 mg/mL)分別加入裝有0.5 mL熱致死副溶血弧菌菌懸液(2×108CFU/mL)的9支離心管中，使 EMA 終濃度分別達到 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和 1.6 μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置約5 min。然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16 cm，曝光20 min。

1.8 死活細胞混合菌懸液的EMA-PCR擴增

在完全一樣的8只離心管中分別加入0.25 mL固定數量(5×107CFU)的熱致死細胞菌懸液與0.25 mL 變化數量(5 ×107、5 ×106、5 ×105、2.5 ×105、5 ×104、2.5×104、5×103和 2.5 ×103CFU)的活細胞菌懸液(生理鹽水漂洗)，混合均勻。向菌懸液中加入0.1 mg/mL的EMA，使EMA終濃度達到1.4 μg/mL。將菌懸液在黑暗中室溫放置5 min，然后將離心管開蓋放置冰上，距離燈管16 cm曝光20 min。曝光后的混合菌懸液在10 000 r/min離心5 min，收集菌體。倒掉上清液后將菌體重懸在0.5 mL的生理鹽水中，10 000 r/min再次離心5 min，收集菌體，倒掉上清液，再次重懸在0.5 mL生理鹽水中，提取模板DNA。

1.9 DNA 模板制備［13－14］

用TZ裂解液(2.0%Triton X－100，2.5 mg/mL的疊氮化鈉，0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH8.0)提取模板DNA。

0.5 mL的各種菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴10 min后冷卻到室溫，8 000 r/min離心5 min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作PCR模板。

1.1 0 引物及PCR擴增

根據GenBank中已發表的副溶血弧菌tlh基因(基因序列號AY578148)序列，利用Primer 5.0軟件設計一對PCR引物，上游引物(P1)為:5＇-AAG CGG ATT ATG CAG AAG CA-3＇，下游引物(P2)為:5＇-GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3＇，擴增片段長度為449bp。優化PCR擴增條件為:25 μL的PCR反應體系中含 4 μL 模板，2.5 μL 的 10 × PCR Buffer，各10pmol的引物，2 μL 的 25 mmol/L MgCl2，2 μL 的2.5 mmol/L dNTP，0.2 μL 的 Taq酶，用滅菌水補足到25 μL體系。PCR反應條件為94℃ 5 min，29個循環，每個循環 94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 2 min，最后 72℃延伸 10 min［15－18］。

1.1 1 PCR產物檢測及定量分析

取10 μL PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳(100 V，1 h)，凝膠成像系統觀察結果并成像。利用NIH1.61圖像分析軟件定量分析混合液中各DNA條帶的相對熒光強度，相對熒光強度取3次獨立實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 副溶血弧菌熱致死時間

將原始菌懸液做梯度稀釋，測定各梯度的OD600nm值，取其中一個梯度懸液涂平板，設3個重復，37℃過夜培養，計算每個梯度的菌濃度。得到活菌的菌濃度隨OD600nm變化曲線，如圖1所示。由圖1可知，當 OD600nm為0.42時，菌濃度正好為2×108CFU/mL。

圖1 菌濃度與OD600nm的標準曲線

95℃水浴處理副溶血弧菌菌懸液(OD600nm為0.42，2×108CFU/mL)，每隔 30s取樣涂平板，每個樣品設3個重復，37℃過夜培養后觀察計數(表2)。結果表明，隨著熱處理時間的增加，其平板菌落數逐漸減少，當熱處理時間延長到9 min時，副溶血弧菌已失活，平板上沒有菌落生長，平板計數為0。因此，為了確保所有副溶血弧菌完全被殺死，得到結果:將濃度為2×108CFU/mL的副溶血弧菌菌懸液在95℃水浴處理10 min，所有副溶血弧菌細胞都已經殺死，平板計數為0。

表1 不同加熱時間處理的活細胞數

2.2 最佳曝光時間

熱致死細胞和活細胞菌懸液(2×108CFU/mL)分別經EMA(終濃度1.4 μg/mL)處理后，曝光1～20 min，結果如圖2和圖3所示。

圖2 EMA處理熱致死細胞的最佳曝光時間優化(A):條帶1～7分別為EMA濃度為1.4μg/mL時熱致死細胞曝光 0、1、3、5、10、15 和 20 min 后的 PCR 凝膠電泳圖。條帶8為陰性對照(不加模板DNA)。M為DNA Marker。(A'):為(A)凝膠電泳圖上相應DNA條帶的相對熒光強度。

圖3 EMA處理活細胞的最佳曝光時間優化(B):條帶1～7分別為EMA濃度為1.4μg/mL時活細胞曝光0、1、3、5、10、15和 20 分鐘后的 PCR 凝膠電泳圖。條帶8為陰性對照(不加模板DNA)。M為DNA Marker。(B＇):為(B)凝膠電泳圖上相應DNA條帶的相對熒光強度。

隨著曝光時間的延長，經EMA(終濃度1.4 μg/mL)處理后死細胞的PCR擴增條帶逐漸變弱，當曝光時間延長到15 min，PCR擴增產物的熒光條帶變得很淡，曝光時間延長到20 min時熒光條帶完全消失(P＜0.01)。而對照組活菌細胞則隨著曝光時間的延長，熒光條帶沒有明顯變化。因此，在整個試驗中都以20 min為最佳EMA曝光時間。

2.3 不抑制活細胞PCR擴增的最大EMA濃度

EMA的不同添加量對活菌PCR擴增的抑制作用電泳圖譜如圖4。隨著EMA濃度的逐漸增加，PCR擴增條帶也逐漸變弱，表明EMA濃度足夠大時對活菌的PCR擴增也有一定抑制作用。圖譜分析可知，當EMA濃度小于等于2 μg/mL時，EMA對活細胞PCR擴增沒有明顯抑制作用(P＞0.01)。然而，當EMA的添加量增加到4 μg/mL時，EMA對活細胞的PCR擴增有顯著的抑制作用(P＜0.01)。因此，在本實驗中我們選擇不抑制活細胞PCR擴增的最大EMA濃度為 2 μg/mL。

圖4 不抑制活菌細胞DNA擴增的最大EMA濃度優化(A):不同EMA濃度下活菌細胞EMA-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為DNA Marker。條帶1～7所對應EMA 濃度分別為 0、2、4、6、8、10 和 12 μg/mL。第 8 泳道為陰性對照(不加模板DNA)。(A＇):為(A)凝膠電泳圖上相應DNA條帶的相對熒光強度。

2.4 完全抑制死細胞PCR擴增的最小EMA濃度

隨著EMA濃度的不斷增加，PCR擴增條帶的亮度越來越弱，當EMA的終濃度等于或者大于1.2 μg/mL時，電泳圖譜上沒有相應的條帶出現，即熱致死細胞的PCR擴增被完全抑制(P＜0.01)(圖5)。此時，1.2 μg/mL的EMA濃度小于可以抑制活細胞PCR擴增的EMA濃度2 μg/mL，因此，為了能夠使死細胞的PCR徹底被EMA抑制，同時又不會抑制活細胞的PCR擴增，實驗中選擇EMA濃度1.4 μg/mL為完全抑制死細胞PCR擴增時EMA的最適濃度。此時，通過EMA-PCR完全能夠區分海產品中副溶血弧菌死活細胞。

圖5 完全抑制死菌細胞DNA擴增的最小EMA添加量的優化(A):不同EMA濃度下死菌細胞EMA-PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。M為DNA Marker。條帶1～9所對應的EMA 濃度分別為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 和1.6μg/mL。第10泳道為陰性對照(不加模板 DNA)。(A＇):為(A)凝膠電泳圖上相應DNA條帶的相對熒光強度。

2.5 相對熒光強度與副溶血弧菌死活細胞混合液中活細胞對數的線性關系

定量的死菌細胞與變化量的活菌細胞的混合液中，死細胞DNA的PCR擴增被EMA(1.4 μg/mL)完全抑制，DNA條帶的相對熒光強度隨著活細胞數(2×105、2 × 104、2 × 103、1 × 103、2 × 102、1 × 102、2 ×101、和1×101CFU/PCR)的減少而逐漸減弱(圖6A)，檢測限能達到10CFU/PCR。而且，由圖6A＇可知，在1×101到2×105CFU/PCR體系范圍內，DNA條帶的相對熒光強度與每個PCR反應體系中所存在的活細胞菌落數的對數值呈現線性關系，在此范圍內可以相對熒光強度來對每個PCR體系中的活菌數進行定量。

3 結論

圖6 DNA條帶相對熒光強度與死活細胞混合液中活細胞對數值的關系(A):變化數量的活細胞(5×107、5 ×106、5 ×105、2.5 ×105、5×104、2.5 ×104、5 ×103和 2.5 ×103CFU)與固定數量(5×107CFU)死活細胞混合液的EMA-PCR擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳圖，EMA終濃度均為1.4 μg/mL。1～8泳道中，每個PCR體系活細胞數分別為2×105、2×104、2 × 103、1 × 103、2 × 102、1 × 102、2 × 101、和 1 ×101CFU;第9泳道為陰性對照(不加模板DNA)。M為DNA marker。(A＇):相對熒光強度與死活細胞混合液中活細胞對數值的線性關系。

本文將DNA染料EMA與傳統PCR技術相結合，研究了純培養副溶血弧菌死活細胞的鑒別方法。研究結果表明，副溶血弧菌中激活和光解EMA的最佳曝光時間為20 min，與類志賀鄰單胞菌(Weimin Gu and Robert E.Levin，2008)、創傷弧菌(Wang and levin，2006)、埃希氏大腸桿菌、單核細胞增生性李斯特菌以及沙門氏菌(Nogva et al，2003)的最佳曝光時間基本相同。不抑制副溶血弧菌活細胞PCR擴增的最大EMA濃度是2 μg/mL，比類志賀鄰單胞菌的5 μg/mL(Weimin Gu and Robert E.Levin，2008)以及創傷弧菌的3 μg/mL(Wang and levin，2006)都要低。完全抑制副溶血弧菌死細胞PCR擴增的最小EMA濃度為1.4 μg/mL，比類志賀鄰單胞菌的0.75 μg/mL(Weimin Gu and Robert E.Levin，2008)要高，但是比創傷弧菌的2.5 μg/mL(Wang and levin，2006)要低，比大腸桿菌、單核細胞增生性李斯特菌以及沙門氏菌(Nogva et al，2003)的10 μg/mL顯著偏低。通過這些數據比較表明，當用EMA-PCR方法區別不同種類微生物死活細胞的時候，完全抑制死細胞PCR擴增的最適EMA濃度以及能夠影響活細胞PCR擴增的最大EMA濃度都需要重新優化［7－11］。

經EMA(1.4 μg/mL)處理定量的死菌細胞與變化量的活菌細胞的混合液，死細胞DNA的PCR擴增被完全抑制，在1×101～2×105CFU/PCR范圍內，活細胞DNA擴增產物的相對熒光強度與每個PCR反應體系中所存在的活細胞菌落數的對數值呈現線性關系，此標準曲線可以用來定量任何來源的樣品中的細菌數。

在本實驗中，副溶血弧菌細胞熱致死的條件是95℃水浴加熱10 min。而Weimin Gu and Robert E.Levin(2008)的類志賀鄰單胞菌的熱致死條件是72℃水浴10 min，Wang and Levin(2006)創傷弧菌的熱致死條件是 100℃條件下5 min，在 Nogva et al(2003)的研究中，埃希氏大腸桿菌、單核細胞增生性李斯特菌以及沙門氏菌被殺死在72℃或者100℃加熱5 min，或者使用其他致死介質(96%的酒精，70%的異丙醇，或者0.1‰的殺藻胺)?？梢?，不同的活菌細胞致死方法也可能會影響到所需要的EMA的濃度［7］。

EMA-PCR是最近新出現的一種有效地區別微生物死活細胞的方法，利用EMA-PCR能夠有效地檢測并快速定量副溶血弧菌死活細胞混合液中的活細胞，從而對人類食品安全檢測發揮重要的作用。

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