植物生長調節劑對五鶴續斷組織培養的影響

張 澤,武 蕓

(1.湖北民族學院 附屬醫院，湖北 恩施 445000；2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室(湖北民族學院)，湖北 恩施 445000)

五鶴續斷屬于川續斷科植物(Dipsacusasper)，其藥用部位為干燥根，是川續斷中的優質品[1]，具有補肝益腎，續接筋骨，抗骨質疏松，止血安胎等功效，臨床上主要用于治療腰膝酸軟，跌打損傷，骨折，腰椎骨質增生，先兆性流產和習慣性流產等癥狀[2].五鶴續斷多糖、總皂甙和總生物堿含量較高[3～5]，其根的熱水提取物中存在著抗補體多糖和具免疫調節活性的高分子活性成分[6]，其提取物有促進骨損傷愈合作用的活性成分[7]，續斷中的總生物堿能顯著抑制子宮平滑肌的自發收縮活動，因此,在臨床上可用來治療先兆性流產和習慣性流產等癥狀[8].五鶴續斷愈傷組織的誘導已有研究[9]，但組織培養的研究國內外均未見報道.本研究用莖尖及多種外植體為材料，旨在解決品種退化問題，保證道地藥材的品質并為其擴大種植提供一條有效途徑，同時還為進一步采用生物技術進行多倍體誘導作好技術準備.

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗所用五鶴續斷均來自生物資源保護與利用重點實驗室(湖北民族學院)植物培養室.

1.2 方法

1.2.1 外植體處理 挑選健壯的五鶴續斷植株，取其莖尖、幼嫩的莖和葉作為外植體，用洗潔精清洗干凈后，流水沖洗2 h，用濾紙吸去多余的水分，在超凈工作臺上用75%的酒精中消毒30 s左右，用無菌水沖洗3遍，再轉入0.1%的升汞溶液中振蕩消毒：莖尖6 min、莖8 min、葉6 min，無菌水沖洗3次，然后置于無菌培養皿中，切除藥液接觸過的傷口并剝去莖的外表皮，切成0.5 cm長的小段，葉切成0.5 cm見方的正方形，接種于附加不同植物生長調節物質及其組合的MS培養基上培養.所有MS培養基中均添加6.0 g/L瓊脂和20 g/L蔗糖，pH在滅菌前調至6.0～6.1.培養條件均為溫度23～25℃、光照強度40 μmol·m-2·s-1、光照時間12 h/d.

1.2.2 初代培養 接種外植體的MS培養基，附加不同植物生長調節物質及其組合，研究其對外植體愈傷組織的誘導效應，從而篩選出誘導愈傷組織的最佳培養基.每個處理接種10瓶，每瓶接種4塊外植體，30 d后計算出愈傷組織塊數和誘導率[3].誘導率=形成愈傷組織的外植體塊數/接種外植體的塊數×100%.

1.2.3 叢生芽誘導 用NAA(0.1、0.3、0.5、0.7、1.0)mg/L和6-BA(1.0、1.5、2.0)mg/L的不同配比，添加到MS基本培養基中，誘導叢生芽的產生.每個處理接種40塊生長比較一致的愈傷組織，培養30 d后測定平均出芽數[10].

注：-：死亡,+：生長勢差，++：生長勢一般，+++：生長勢較好，++++：生長旺盛，以下同上.

圖1 五鶴續斷愈傷組織的增殖曲線

1.2.4 生根培養 將高2 cm左右的芽苗剪下，轉入到1/2MS生根培養基中培養，培養基中附加激素(NAA和多效唑)、6.0 g/L瓊脂和20 g/L蔗糖，pH5.8.每個處理接種30根芽苗，30 d后測定平均生根數.

2 結果與討論

2.1 不同植物生長調節物質組合的誘導效應

將外植體接種到NAA+6-BA和2,4-D+6-BA兩種組合的MS培養基中進行初代培養，結果表明(見表1)，MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.1 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L的愈傷誘導效果較好，其誘導率分別達到了92.5%和91.7%，但愈傷組織在色澤、質地和生長勢方面均表現不同，前者所得愈傷組織呈深綠色、質地較好，生長較快，適合于快速繁殖；后者誘導的愈傷呈黃綠色，質地較硬，不利于快繁.因此，MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L為初代培養的最佳培養基.

2.2 不同外植體的誘導效應

不同類型外植體誘導愈傷組織的效果不同：莖尖、幼嫩的莖段和葉作為外植體都能誘導出愈傷組織，其誘導率分別為76.67%、83.33%和40.00%，其中以莖尖和幼嫩的莖段誘導愈傷率較高，生長勢好；葉誘導愈傷率較低，愈傷呈黃色泡狀，繼代后死掉了，不適于用作快繁的外植體.莖尖培育的幼苗可達到脫毒效果，能有效防止品種退化，因此，莖尖是較理想的外植體.

2.3 光照的影響

用誘導愈傷組織的最優培養基MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L進行繼代培養.每瓶接種鮮重1 g且色澤一致的愈傷組織，一部分置于光強為40 μmol·m-2·s-1，12 h/d，溫度為25℃左右條件下培養；另一部分置于暗培養箱中對照培養.每3 d取兩種條件下培養的愈傷組織稱重，計算愈傷組織的鮮重，并重復3次，取其平均值，其結果如圖1所示.

研究結果顯示，其愈傷組織的生長可明顯地分為3個時期：延遲生長期(0～9 d)、指數生長期(9～24 d)和靜止(24～30 d)期.愈傷組織在延遲期生長緩慢，在指數生長期愈傷組織鮮重急劇增加，在靜止期愈傷組織鮮重增加幾乎停止，由此可見愈傷組織在光照下長勢好，并且愈傷組織的顏色呈深綠色,結構較疏松；在暗培養中愈傷組織呈黃白色，長勢較慢.

2.4 叢生芽誘導

用生長較一致的綠色愈傷組織為材料，用6-BA和NAA的不同質量分數誘導叢生芽產生，結果表明(見表2)，培養基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L誘導叢生芽個數最高，芽苗生長健壯，因此，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L為誘導叢生芽的最優培養基.

表2 不同激素配比誘導叢生芽的效果(質量分數均為mg/L)

表3 不同激素配比誘導生根的效果(質量分數均為mg/L)

2.5 生根培養

用IBA和多效唑(PP333)的不同質量分數來誘導五鶴續斷生根，結果表明(見表3)：單獨使用IBA時可以誘導生根，以質量分數為0.4 mg/L時最佳；在培養基中添加多效唑(PP333)后可促進生根，使生根數大大增加，綜合考慮因素IBA和PP333的影響，誘導生根的最佳培養基為1/2MS+IBA 0.4 mg/L+PP3330.4 mg/L.

2.5 煉苗與移栽

將生根后的芽苗長到高5～6 cm、根長約3 cm時開始煉苗.先打開培養瓶蓋，置于室溫散射光下，補加適當的蒸餾水進行煉苗.煉苗3～4 d后取出試管苗，洗去根部培養基，移栽入裝有滅過菌的草炭+蛭石(2∶1)的花盆中，并適時澆以霍格蘭營養液，放入溫室中培養，濕度保持90%左右，三周后移栽.移栽后每天至少兩次噴灑適量水(土潤濕為止)，移栽后的小苗注意保濕、遮蔭和適當通風，小苗成活率可達85%以上.

3 結論

在五鶴續斷組織培養過程中，以莖尖為外植體可避免內生菌的產生，是較理想的實驗材料.莖尖產生的愈傷組織分化較好，是防止品種退化的最有效途徑.本研究確定了五鶴續斷組織培養的最佳培養基為：

1)初代培養基MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；

2)叢生芽誘導培養基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L；

3)生根培養基1/2MS+IBA 0.4 mg/L+PP3330.4 mg/L.

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