blaTEM-116型超廣譜β-內酰胺酶的表達、純化及其應用

王震，鄭穎，范泉水，陳秀樞，呂建新

1 溫州醫學院檢驗與生命科學學院 微生態學研究所，溫州 325035

2 成都軍區軍事醫學研究所，昆明 650032

超廣譜 β-內酰胺酶 (Extended-spectrum βlactamase，ESBL) 是細菌在超廣譜β-內酰胺抗生素選擇壓力下產生的一類耐藥酶，能夠降解大部分青霉素類、3代以下頭孢菌素類的 β-內酰胺抗生素，主要機制是水解該類抗生素母環的酰胺鍵而導致細菌的耐藥性。TEM型ESBL是一種主要的亞群，攜帶blaTEM，由blaTEM-1或blaTEM-2發生一個或數個位點的突變而形成具有不同底物譜的TEM型ESBL。與TEM-1酶相比，TEM-116 ESBL存在著2個氨基酸位點的突變(Val 84→Ile，Ala 184→Val)，使其底物輪廓具備超廣譜酶的特征，具有分解絕大部分 β-內酰胺類抗生素的能力[1-2]。自2002年Vignoli等[1]報道自臨床樣本分離出攜帶blaTEM-116的Escherichia coli以來，世界各地不斷發現產TEM-116 型ESBL的流行株[3]。

β-內酰胺類藥物是應用廣泛的抗生素，涉及醫療業、制藥業、農業及養殖業等領域。因此，在某些特定外環境中存在著大量未經降解的該類抗生素，如制藥廠排出的工業發酵廢水、病人排泄物和醫源性污水、食品制造業的奶制品與肉制品等都可能涉及抗生素污染問題，從而導致耐藥菌株的形成與流行。因此，抗生素對環境、食品、醫療場所的污染與耐藥菌的傳播，以及醫院內感染等問題已經引起廣泛的關注[4-8]。

本研究采用“逆向思維”的科學方法，把TEM-116 ESBL這種具有超廣譜特征的耐藥酶開發成具有潛在應用價值的工具酶，用于清除醫源性排泄物、藥廠工業性發酵廢液中的β-內酰胺抗生素，在其經過嚴格的安全性評價并經監管部門批準的前提下，結合酶固定化技術有望用于清除液態食品中的 β-內酰胺抗生素，并嘗試性地將其用于降解體內青霉素G。通過構建高效表達的TEM-116 ESBL原核工程菌，對其發酵、表達及純化條件進行優化，并對TEM-116 ESBL的酶動力學特性和應用于特定樣本的可行性進行較為系統的研究，初步證明其具備工具酶的穩定特征，為進一步推廣應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

含pUCm-TEM-116質粒的E. coli DH5α菌株、金黃色葡萄球菌ATCC 25923標準株由溫州醫學院細胞與分子醫學研究所提供；blaTEM-116(AY425988)來自溫州醫學院附屬第一醫院微生物科保存的產ESBL的 E. coli臨床株；原核表達載體pET-28a及宿主菌E. coli BL21(DE3) 購自美國Novagen 公司。

1.2 酶及主要試劑

限制性內切酶NcoⅠ、XhoⅠ、Taq酶、T4 DNA連接酶、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Sephacryl S100 (XK 50/100)、Ni2+-NTA瓊脂糖 (XK 16/20)、Sephadex G25 (XK 50/100)、DE-52 (XK 26/40) 購自GE Healthcare；戴爾沃 (Delvotest SP) β-內酰胺類抗生素檢測試劑盒購自Gist-Brocades；青霉素G (Penicillin G，PG)、氨芐青霉素 (Ampicillin，Amp)、阿莫西林 (Amoxicillin，AMXC)、哌拉西林 (Piperacillin，PIPC)、頭孢氨芐(Cephalexin，CEL )、頭孢唑林 (Cefazolin，CEZ)、頭孢哌酮(Cefoperazone，CPZ)、頭孢噻肟 (Cefotaxime，CTX) 等抗生素均購自中國藥品生物制品檢定所；天然TEM-ESBL酶為自行表達與純化；青霉素發酵基礎培養液按文獻[9]方法配制。

1.3 重組質粒的構建和鑒定

將 pUCm-TEM-116和 pET28a質粒分別進行NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切，將酶切產物回收純化，用T4 DNA 連接酶于 16℃連接 3 h，然后轉化 E. coli BL21(DE3)，將轉化菌涂布于含30 μg/mL卡那霉素的 LB平板上，37℃培養過夜，挑取單菌落擴大培養，提取質粒NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切、電泳鑒定，提取的質粒送大連寶生物公司測序。

1.4 blaTEM-116的表達、復性、純化及理化性質檢測

1.4.1 blaTEM-116的表達、復性和純化

重組菌接種于70 mL LB培養基 (含30 μg/mL卡那霉素) 中，于37℃、150 r/min振蕩培養11 h。次日，70 mL種子接種于含7 L的LB培養基 (含30 μg/mL卡那霉素)的發酵罐，發酵罐設置參數為：37℃；溶氧率45%；pH 7.0。當菌體生長至OD600為1.7~1.8時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L，待菌體濃度不再升高1 h后，開始撤罐，離心收集菌體。

細菌懸浮于PBS (20 mmol/L，pH 7.4)，超聲裂解，于4℃、15 000 r/min離心15 min，取沉淀用包涵體洗滌液 (10 mmol/L EDTA，0.5% Triton X 100，pH 8.0)重懸，室溫放置5 min，15 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀溶于100 mL包涵體裂解液 (8 mol/L urea，10 mmol/L DTT，pH 7.4)，以打開目的蛋白中錯配二硫鍵。室溫放置30 min后，用?KTA explore蛋白純化儀純化，先進行 Ni2＋-NTA瓊脂糖親和層析柱(XK16/20)純化，Binding buffer (5 mmol/L imidazole，0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，20 mmol/L Tris-HC1，pH 8.0) 為上樣緩沖液，每次取10 mL裂解液，以1 mL/min流速緩慢經過Binding buffer平衡后的親和層析柱，以便目的蛋白充分復性、結合。用 Wash buffer (0.5 mol/L NaCl，60 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9) 洗去雜蛋白，再用10 mL Elute buffer (1 mol/L imidazole，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9) 洗脫復性目的蛋白，該洗脫液再進行分子篩層析純化，洗脫液上樣于經 10 mmol/L NaH2PO4-Cit緩沖液(pH 6.6) 預平衡的Sephacryl S-100 (XK50/100) 柱，繼續用該緩沖液以5 mL/min的速度洗脫，最后目的蛋白收集液以Sephadex G25 (XK50/100) 柱脫鹽，收集液凍干、復溶后，進行酶的活性檢測、SDS-PAGE電泳及其bandscan V5.0蛋白掃描分析軟件分析純度。

產酶天然菌發酵液加Amp至終濃度30 μg/mL，不加誘導劑，其他發酵條件同重組菌。細菌離心后所得裂解液上清共 100 mL，加硫酸銨至 45%飽和度，靜置15 min，15 000 r/min 離心15 min，取上清加硫酸銨至75%飽和度，離心15 min，沉淀重新溶于 100 mL的 10 mmol/L NaCl、10 mmol/L NaH2PO4-Cit (pH 7.0) 混合溶液中，沉淀溶解液上樣于經同一緩沖液液平衡的陰離子交換柱 DE-52 (XK26/40)，以梯度10~300 mmol/L NaCl的10 mmol/L NaH2PO4-Cit (pH 7.0) 混合液進行梯度洗脫，取收集峰中段活性最高的小部分溶液，對其隨后進行的Sephacryl S-100、Sephadex G25層析、脫鹽及其凍干同上。

1.4.2 TEM-116 ESBL理化性質檢測

TEM-116 ESBL 委托上?；倒具M行N末端氨基酸測序。

Bradford法測定蛋白含量[10]，紫外吸收法測定酶對底物的水解率[11]。以PG為底物，0.1 mol/L pH 7.0的PBS為緩沖液，OD233時測定PG吸光度變化，計算酶活性。一個國際單位 (IU) 酶活性定義為pH 7.0、37℃條件下，每分鐘水解1 mmol底物的酶量。

1.5 TEM-116 ESBL動力學特性檢測

重組、天然TEM-116 ESBL和抗生素均以PBS (0.01 mol/L、pH 7.0)溶解，在200~400 nm 紫外區間進行掃描，確定測定波長。根據Lee-Wilson 的改良雙倒數方程標準，測定動力學參數，求Km與Vmax，根據反應體系中加入酶量計算Kcat及其他衍生參數[3]。

1.6 TEM-116 ESBL降解環境中β-內酰胺類藥物的應用

1.6.1 模擬藥廠發酵廢液與病人尿液中β-內酰胺類藥物的清除

向青霉素發酵基礎培養液加入PG，使其濃度分別為1000 mg/L和7000 mg/L，模擬制藥廠青霉素發酵液 (pH 6.0)；向尿液中加入等量的 Amp、PG和CEZ混合液，使其終濃度分別為8 mg/L和200 mg/L，模擬含抗生素的病人尿液 (pH 5.5)。向上述樣本中加入不同量的TEM-116 ESBL，25℃下分別降解12 h和2 h。取降解后的樣本0.1 mL，經Delvotest SP法[12]確認是否有抗生素殘留。

1.6.2 液態牛奶中PG的清除

不含抗生素的新鮮液態牛奶中加入 PG至終濃度為80 U/L，考慮到實際應用的簡便性，設計3個溫度條件為4℃、25℃和37℃，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 IU的TEM-116 ESBL，作用0.5 h后，經Delvotest SP法確認是否有抗生素殘留。

1.6.3 小鼠體內青霉素G的清除

將30只昆明鼠隨機分成6組，每組5只，經預實驗確定，給以藥物和酶的劑量如下：第1組：空白對照組；第2組：PG 200 μg (8.0~9.1×103μg /(kg·bw))；第 3組：PG 200 μg +200 IU TEM-116 ESBL (8.0×103~9.1×103IU/(kg·bw))；第4組：PG 200 μg+ 300 IU TEM-116 ESBL (1.2×104~1.4×104IU/(kg·bw))；第5組：PG 2000 μg (8.0×104~9.1×104μg /(kg·bw))+ 400 IU TEM-116 ESBL (1.6×104~1.8×104IU/(kg·bw))；第 6組：PG 2000 μg +500 IU TEM-116 ESBL (2.0×104~ 2.3×104IU/(kg·bw))。

實驗鼠尾靜脈注射0.2 mL不同濃度的PG，0.5 h后，再注射不同濃度的TEM-116 ESBL溶液，10 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，取四肢的肌肉，無菌雙蒸水洗凈，吹干，取約2 g剪碎的組織放入4 mL EP管內，加1 mL無菌雙蒸水，勻漿1 min，14 000 r/min離心5 min，取0.1 mL上清液經Delvotest SP法檢測是否有PG殘留，每組2只進行觀察。

2 結果

2.1 pET28-TEM-116重組質粒的構建

重組質粒的構建如圖1所示，該方法保證了重組表達的TEM-116 ESBL在pET 28a質粒的T7啟動子控制下，形成 6×His的融合蛋白。工程菌中提取的重組質粒經Nco I和Xho I雙酶切后得到863 bp和5235 bp兩條片段 (圖2)。酶切圖譜與預期結果完全一致，重組質粒經測序，確證blaTEM-116已成功克隆至pET28表達載體上。

2.2 blaTEM-116的高效表達、復性、純化及理化性質檢測

2.2.1 blaTEM-116的高效表達、復性和純化

濕重為45 g的細菌所制備的TEM-116 ESBL包涵體先后經親和及分子篩層析的純化與復性。在親和層析后，洗脫液蛋白紫外吸收峰 (圖 3A) 可見 2個峰，峰1分子量較大，推測為前體TEM-116 ESBL峰 (32 kDa)，峰2分子量較小，推測為成熟TEM-116 ESBL峰 (30 kDa)。其洗脫液經Sephacryl S100分子篩純化后，分別收集峰1和峰2蛋白，再經Sephadex G25脫鹽后，獲得69.2 mg、比活性為476 IU/mg的成熟TEM-116 ESBL，即目的蛋白(洗脫峰見圖3B)。另一純化的前體 TEM-116 ESBL經測定比活性為39 IU/mg。

圖1 重組質粒pET28-TEM-116的構建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid of pET28-TEM-116.

圖2 重組質粒pET28-TEM-116的雙酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant pET28-TEM-116 digested with Nco I and Xho I. M: DL 15000 marker; 1: pET28-TEM-116 digested with Nco I and Xho I.

經SDS-PAGE電泳，親和層析純化前后的樣品(圖4，泳道2和3) 同時存在30 kDa和32 kDa兩個蛋白條帶，表明它們都含有 His標簽；分子篩層析分離的蛋白條帶 (圖4，泳道1和4) 證明其分子量分別為30 kDa 和32 kDa；上述結果與預期一致。經蛋白掃描分析軟件分析圖4之泳道1和4，蛋白條帶純度均達到90%以上。

2.2.2 TEM-116 ESBL的 N末端測序

圖3 重組TEM-116 ESBL的洗脫曲線 (280 nm)Fig. 3 Protein trace (continuous line, 280 nm) during elution of the recombinant TEM-116 ESBL. (A) Protein trace (continuous line, 280 nm) during elution of the recombinant TEM-116 ESBL from the Ni2＋-NTA affinity chromatograph column (AU=absorbance units). 1: the precursor TEM-116 ESBL(32 kDa, 39 IU/mg); 2: the mature TEM-116 ESBL (30 kDa, 476 IU/mg). (B) Protein trace (continuous line, 280 nm;) of desalting the mature TEM-116 ESBL from the Sephadex G 25 column during elution.

圖3A中峰2與圖3B相應所純化的TEM-116 ESBL經測序，其N端前9個氨基酸分別為HPETLVKVK，與推導的及GenBank所公布的成熟TEM-116 ESBL (Accession No. AY425988) N端氨基酸完全一致。表明高活性的30 kDa酶蛋白為成熟TEM-116 ESBL。本研究中動力學特性及其應用實驗均采用該重組蛋白。

2.3 TEM-116 ESBL的動力學特性

圖4 SDS-PAGE檢測純化的TEM-116 ESBLFig. 4 SDS-PAGE analysis of the purified TEM-116 ESBL from inclusion bodies. M: protein marker; 1: purified mature TEM-116 ESBL; 2: inclusion bodies after dialysis; 3: inclusion bodies after affinity chromatography; 4: purified precursor TEM-116 ESBL.

自行分離純化的天然TEM-116 ESBL的比活性為461 IU/mg，與重組酶的比活性 (476 IU/mg) 相近，用SPSS 11.0統計學軟件對兩種酶的Km、Kcat、Kcat/Km三項參數進行配對t 檢驗，結果表明 (表1)，天然酶與重組 TEM-116 ESBL的 Km(t=1.334，P= 0.202)、Kcat(t=1.362，P=0.193)、Kcat/Km(t=1.479， P= 0.160)，無顯著性差異。TEM-116 酶對 CPZ親和力最高，表明 CPZ是該酶的最優底物，其次是CEL。用催化常數評價，該酶對AMXC、Amp和PG的催化遠高于其他頭孢類藥物，表明在底物飽和的情況下，對青霉素類具有較快的轉化率；而頭孢菌素中，則對CEZ具有較高的催化效率，但仍遠小于Amp。就綜合效率參數Kcat/Km而言，青霉素類藥物是最容易被TEM-116 ESBL所降解的抗生素。這些均說明：重組和天然TEM-116 ESBL之間在酶催化動力學方面無顯著差異；且該酶具有超廣譜酶的底物譜、對底物的親和力 (Km) 較強；同時，其催化效率 (Kcat) 也表明它具備較好的工具酶特征。

2.4 TEM-116 ESBL降解環境中β-內酰胺類藥物的應用

2.4.1 模擬藥廠發酵液與尿液中β-內酰胺類藥物的清除

實驗結果顯示 (表2)：25℃下作用12 h后，5.0 IU TEM- 116 ESBL可清除1 L模擬發酵液 (pH 6.0) 中的1000 mg PG，10.0 IU 該酶可清除1 L發酵液中的7000 mg PG；而25℃下作用2 h，5.0 IU 該酶可清除1 L模擬病人尿液 (pH 5.5) 中Amp、PG和CEZ各為8 mg 的混合抗生素，320.0 IU TEM-116 ESBL可清除1 L尿液中的Amp、PG、CEZ各為200 mg混合抗生素。表明該酶在不同應用介質中具有穩定的活性，能夠高效地降解模擬發酵液、病人尿液中β-內酰胺類藥物。

表1 天然與重組TEM-116 ESBL的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of native and recombinant TEM-116 ESBL

表2 TEM-116 ESBL清除發酵液 (pH 6.0) 及尿液(pH 5.5) 中的β-內酰胺抗生素Table 2 Elimination of β-lactam antibiotics in fermental liquid medium(pH 6.0)and urine(pH 5.5) by TEM-116 ESBL

表3 TEM-116 ESBL清除牛奶中的PG (80 U/L PG，0.5 h)Table 3 Elimination of PG in milk by TEM-116 ESBL (80 U/L PG, 0.5 h)

2.4.2 牛奶中PG的清除

牛奶中添加PG至終濃度為80 U/L，分別在4℃、25℃和37℃下作用0.5 h，實驗結果表明 (表3)：1.0、1.5和2.5 IU TEM-116酶分別在4℃、25℃和37℃溫度條件下，經0.5 h清除牛奶中80 U/L的 PG。

2.4.3 小鼠體內PG的清除

由表4可見，1.2×104~1.4×104IU/(kg·bw) 酶能夠完全清除 8.0×103~9.1×103μg/(kg·bw) 的 PG；2.0×104~2.3×104IU/(kg·bw) 酶可完全清除 8.0×104~ 9.1×104μg/(kg·bw) 的PG。各組留觀20 d的小鼠未見異常死亡。該結果表明TEM-116 ESBL作為一種小分子蛋白 (30 kDa)，能夠通過血管屏障，并在體內仍保留一定的活性。

3 討論

本研究利用原核表達系統，將TEM-116 ESBL進行包涵體表達，并建立了實驗室中試規模的表達與純化的技術路線，濕重45 g細菌的包涵體，經系列步驟純化，共獲取69.2 mg (476 IU/mg，計32 939 IU)TEM-116 ESBL。相比較復雜的包涵體復性，通過與純化同步的柱上復性則得以簡化。此外，實驗也證實了TEM-116 ESBL所含的信號肽能被細菌水解酶所切割，從而形成前體和成熟TEM-116 ESBL兩種酶蛋白。實驗中獲取的前體 TEM-116 ESBL (32 kDa，39 IU/mg)活性較低，可能的原因是前體和成熟酶蛋白半胱氨酸數目差異而導致的復性率不同，如成熟酶蛋白有2個半胱氨酸，復性時只能形成1個二硫鍵；而前體酶蛋白有3個半胱氨酸，復性需形成3個正確配對的二硫鍵，導致酶的復性率較低。因此，若進一步的研究中實現將更多的前體酶蛋白轉換為成熟酶蛋白，該酶的復性率很可能顯著提高。

表4 TEM-116 ESBL清除小鼠體內的PGTable 4 Elimination of eliminating PG in vivo mouse by TEM-116 ESBL

抗生素的發明和應用是人類戰勝感染性疾病的最有力武器，但是，在醫療、預防、工農業等領域的廣泛使用乃至濫用也給人類帶來了嚴重的生物安全問題，如人體和環境中的病原微生物耐藥性形成與互相傳播呈高發趨勢[3-7]，最近，Pellegrini等報道在城市污水和醫療環境中的假單胞菌屬中分離出一種新型的具有超廣譜特征的金屬型內酰胺酶變種——IMP 22酶[13]。另外，在歐洲地區的調查也發現腸桿菌屬細菌具有很高的 ESBL產生率[14]，而這些菌屬都是臨床最常見的致病菌。因此，探尋有效遏制環境相關微生物耐藥性傳播的手段是非常必要的。本研究初步證明TEM-116 ESBL對模擬的青霉素藥廠生產性廢液 (pH 6.0) 和模擬的 β-內酰胺類抗生素治療病人尿液 (pH 5.5) 中所含的青霉素類和頭孢菌素類藥物都具有較高的降解效率，其中，5.0 IU和10.0 IU的酶在25℃條件下作用12 h，能夠分別降解發酵廢液中所含的1000 mg/L與7000 mg/L的PG；Amp、PG和CEZ各為8 mg/L和200 mg/L的病人尿液樣本中的混合抗生素，僅分別需要5.0 IU和320.0 IU TEM-116 ESBL即可完全清除。酶的動力學實驗結果同樣表明該酶對絕大部分 β-內酰胺藥物具有較高和較穩定的催化效率，且重組酶和天然酶在酶動力學的Km、Kcat、Kcat/Km等參數方面相近。這些結果提示，可以將TEM-116 ESBL開發成環境保護制劑應用于消除高 β-內酰胺抗生素污染的相關領域，從而達到有效遏制環境相關病原微生物耐藥性形成與傳播的目的。

由于抗生素在動物飼料、生長促進劑、疾病治療與預防等方面具有獨特的作用，因此，動物源性食品中抗生素的殘留和污染也是廣泛存在的生物安全與食品安全問題[15-16]。如我國奶牛的乳腺炎等疾病發病率高，PG為代表的β-內酰胺類抗生素由于價廉、有效，為廣大奶農作為首選治療用藥，用藥期間及其后的一段時間牛奶中產生高濃度的抗生素，此外，部分飼料中也可能被抗生素污染或人為添加，因此，短期內還不能從源頭上杜絕抗生素對牛奶的污染。早在1985年，Korycka-Dahl M等就使用粗制的β-內酰胺酶分解殘留于牛奶中的 PG，但是，由于酶的來源為天然粗制酶，所以，其生物安全性和酶的活性都不理想[17]。本實驗利用重組TEM-116 ESBL成功地降解了奶樣中的 PG，但由于目前 TEM-116 ESBL尚處于安全性評價階段，故不推薦實際應用。而通過運用酶固定化技術，可在不向牛奶中直接投放酶添加劑的基礎上清除 β-內酰胺抗生素，該技術的應用有望使該工具酶較早通過食品藥監部門的認定，而進入實用階段。為了進一步證明 TEM-116 ESBL這種小分子酶蛋白是否具備體內分解 PG能力，研究中進行了小鼠體內藥物降解實驗，結果發現：1.2×104~1.4×104IU/(kg·bw) 酶能完全清除 8.0×103~ 9.1×103μg/(kg·bw) 的PG；2.0×104~2.3×104IU/(kg·bw)酶可完全清除8.0×104~9.1×104μg/(kg·bw) 的PG。每組2只留觀鼠經20 d觀察，未見異常死亡。該結果表明TEM-116 ESBL作為30 kDa的小分子蛋白，能夠通過血管屏障，并在體內呈現其酶的活性。關于把 ESBL作為新型食品添加 (處理) 劑的安全性問題，筆者認為涉及兩個方面，其一是酶自身的安全，其二是分解產物的安全。由于該酶是由耐藥菌產生，因此，在人體的胃腸道、呼吸道、陰道等微生態區域均天然存在，故亦不應有酶自身或免疫學方面的危害；而關于抗生素分解后次級產物的毒副作用問題，有必要進行系統的毒理學安全性評價，或者通過優化技術手段如固定化酶膜等方法加以克服。

總之，本研究采用“逆向思維”的科學方法，把 ESBL由廣泛存在于體內微生態菌叢中的耐藥酶轉化為具有潛在應用價值的工具酶，并取得了實驗支持，為其進一步的推廣應用奠定了基礎。

REFERENCES

[1] Vignoli R, Varela G, Mota MI, et al. Enteropathogenic Escherichia coli strains carrying genes encoding the PER-2 and TEM -116 extended-spectrum beta-lactamases isolated from children with diarrhea in Uruguay. J Clin Microbiol, 2005, 43(6): 2940–2943.

[2] Hu GZ, Chen HY, Si HB, et al. Phenotypic and molecular characterization of TEM-116 extended-spectrum betalactamase produced by a Shigella flexneri clinical isolate from chickens. FEMS Microbiol Lett, 2008, 279(2): 162–166.

[3] Lin TL, Tang SI, Fang CT, et al. Extended-spectrum beta-lactamase genes of Klebsiella pneumoniae strains in Taiwan: recharacterization of SHV-27, SHV-41, and TEM-116. Microb Drug Resist, 2006, 12(1): 12–15.

[4] Brown KD, Kulis J, Thomson B, et al. Occurrence of antibiotics in hospital, residential, and dairy effluent, municipal wastewater, and the Rio Grande in New Mexico. Sci Total Environ, 2006, 366(2/3): 772–783.

[5] Iversen A, Kuhn I, Rahman M, et al. Evidence for transmission between humans and the environment of a nosocomial strain of Enterococcus faecium. Environ Microbiol, 2004, 6(1): 55–59.

[6] Clancy MJ, Graepler A, Breese PE, et al. Widespread emergence of methicillin resistance in community-acquired Staphylococcus aureus infections in Denver. South Med J, 2005, 98(11): 1061–1062.

[7] Aygun G, Demirkiran O, Utku T, et al. Environmental contamination during a carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii outbreak in an intensive care unit. J Hosp Infect, 2002, 52(4): 259–262.

[8] Venglovsky J, Sasakova N, Placha I, et al. Pathogens and antibiotic residues in animal manures and hygienic and ecological risks related to subsequent land application. Bioresour Technol, 2009, 100(22): 5386–5391.

[9] Kennedy M, Krouse D. Strategies for improving fermentation medium performance: a review. J Ind Microbiol Biotechnol, 1999, 23: 456–475.

[10] Read SM, Northcote DH. Minimization of variation in the response to different proteins of the coomassie blue G eye-binding assay for protein. Anal Biochen, 1981, 116(1): 53–64.

[11] Lorian V. Antibiotics in Laboratory Medicine. 4th ed. New York: Lippincott Williams & Wilkins Press, 1996: 503–578.

[12] Suhren G, Beukers R. Delvotest SP for detection of cloxacillin and sulfamethoxazole in milk: IDF interlaboratory study. J AOAC Int, 1998, 81(5): 978–990.

[13] Pellegrini C, Mercuri PS, Celenza G, et al. Identification of bla(IMP-22) in Pseudomonas spp. in urban wastewater and nosocomial environments: biochemical characterization of a new IMP metallo-enzyme variant and its genetic location. J Antimicrob Chemother, 2009, 63(5): 901–908.

[14] Cantón R, Novais A, Valverde A, et al. Prevalence and spread of extended-spectrum beta-lactamase-producing enterobacteriaceae in Europe. Clin Microbiol Infect, 2008, 14(11): 144–153.

[15] Prescott JF. Antimicrobial use in food and companion animals. Anim Health Res Rev, 2008, 9(2): 127–133.

[16] Hammad AM, Ahmed AM, Ishida Y, et al. First characterization and emergence of SHV-60 in raw milk of a healthy cow in Japan. J Vet Med Sci, 2008, 70(11): 1269–1272.

[17] Korycka-Dahl M, Richardson T, Bradley RL, et al. Use of microbial beta-lactamase to destroy penicillin added to milk. J Dairy Sci, 1985, 68(8): 1910–1916.