實驗性腦缺血后主要炎癥相關信號的傳遞和作用關系

徐虹,陳素輝,孫華

炎癥在早期急性腦血管病發生中有重要的作用。早期的炎癥往往具有保護作用,持續強烈的炎癥反應卻是有害的。腦缺血發生之后,大量白細胞涌入缺血腦組織,激活機體的炎癥反應。通過再灌注,活性氧(ROS)激活,進一步導致缺血細胞(主要是小膠質細胞)甚至是神經元產生包括炎癥因子的分泌、血管黏附分子的上調、外周白細胞的募集等的變化。外周白細胞也通過缺損的血腦屏障進入缺血區,導致下游的次級炎癥反應的激活,炎癥因子釋放增多、基質金屬蛋白酶(M MPs)表達增加、活性氧生成增多等,并形成惡性循環。這些炎癥細胞和因子互相作用,共同調控腦缺血后炎癥反應的結果,近來有學者把這種神經元-膠質細胞,內皮細胞-周圍微血管的協同作用模式稱為神經血管單元[1]。

血管炎癥反應涉及炎癥細胞、內皮細胞(ECs)、血管平滑肌細胞(VSMCs)及細胞外基質(ECM)等復雜的聯系。這些細胞及作用產物共同作用,構成炎癥狀態。內皮細胞激活后,其表達黏附分子的增多造成炎癥細胞及細胞因子的募集,炎癥細胞及細胞因子作用于內皮細胞、平滑肌細胞及細胞外基質,與這些細胞上相應的受體結合,并激活 JAK-STAT、核因子-κ B(NF-κ B)以及Smad信號途徑參與細胞黏附、浸潤及凋亡等炎癥反應。細胞因子還通過影響整合素及基質金屬蛋白酶調控ECM的合成。

1 腦缺血炎癥相關細胞

1.1 內皮細胞 在正常的靜息條件下內皮細胞具有抗血栓及抗炎的作用。其炎癥作用來源于對白細胞黏附受體(如P選擇素)的集聚以及對細胞基質黏附受體的募集。內皮細胞不僅可以聚集已經生成的黏附分子,也是一部分黏附分子的產生場所。在內皮細胞的腔面,細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、E選擇素在這里表達和生成。外周循環炎癥細胞通過黏附分子受體與內皮細胞緊密黏附,這樣,炎癥細胞就可以進入受損的神經纖維網。

1.2 小膠質細胞和巨噬細胞 小膠質細胞是腦組織固有的細胞,在腦缺血后早期(2～4 h)就被激活,導致局部促炎細胞因子的釋放。在腦組織的感染、炎癥、外傷及缺血變性中具有“清道夫”的作用。一旦被激活,小膠質細胞就經過形態學的轉變,與循環中的巨噬細胞沒有區別。其主要作用是在腦缺血后釋放很多具有細胞毒性或細胞保護性的物質。它在腦缺血后損害作用的直接證據是,當在有神經元或者少突膠質細胞的培養基中,損傷會加重。但是小膠質細胞是如何在腦缺血中被激活,機制尚不清楚。也有一部分的證據表示,小膠質細胞、巨噬細胞或者其分泌的因子也可能具有保護作用[2]。用脂質體包裹的氯屈磷酸二鈉去除外周的巨噬細胞之后,并沒有發現對腦梗死體積有任何影響[3]。原因可能是后者并沒清除腦組織中固有的巨噬細胞,這也可能暗示是腦組織固有的而不是循環中的巨噬細胞在缺血損傷中起重要作用。

1.3 星型膠質細胞 除了常規的炎癥細胞,星型膠質細胞也表達不同的炎癥介質。腦缺血后,星型膠質細胞激活并導致膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)表達并發生所謂“一過性的神經膠質增多癥”。星型膠質細胞可以釋放一些炎癥因子,比如細胞因子、趨化因子、誘導性一氧化氮合酶(iNOS)等。很多數據都表明,正常的星型膠質細胞在神經元功能方面發揮重要作用,但是一旦激活,對腦缺血大腦可能是有害的。

1.4 白細胞 在促炎細胞因子的作用下,外周血細胞在內皮上黏附,穿過血腦屏障最終到達受損區域。不同的白細胞亞型募集的時間不同,首先是中性粒細胞,其次是單核細胞,再次是巨噬細胞及少量的淋巴細胞。一項動物實驗表明,中性粒細胞的集聚最早可以追溯到腦缺血后1～4 h,并且可以持續96 h[4]。用流式細胞儀觀察腦缺血后小鼠炎癥細胞表達時程的研究表明,激活的粒/單核細胞最早在缺血后18 h出現,相對于淋巴細胞(72及96 h)要早[4]。外周循環血細胞的浸潤(主要是中性粒細胞)在細胞死亡和修復中有多重作用,其作用主要與其表達的時程有關。腦缺血發生后選擇性的白細胞剔除可以減少腦梗死面積,這可以說明循環血細胞的介入擴大了腦缺血損傷,至少是在缺血的急性期,并且這種作用是通過微血管的堵塞及毒性炎癥介質的放大來實現的[4-5]。對于淋巴細胞的作用報道不盡一致。在大鼠永久性大腦中動脈閉塞(MCAO)模型后,檢測到淋巴細胞水平繼中性粒細胞之后升高[6]。

2 腦缺血后炎癥相關因子

大多數的炎癥介質在正常中樞神經系統組織中低劑量的表達,或者很難被檢測到。但是一旦發生組織損傷或者感染就不同了。主要分為兩類:促炎細胞因子及抗炎細胞因子。有些細胞因子已經明確是促炎性質的,如 IL-1β、TNF-α、INF-γ等;抗炎性質的有IL-10、TNF-β;還有的如IL-6,目前在炎癥中的作用還有爭議。

2.1 白細胞介素類 IL-1又分為白細胞介素IL-1β和IL-1α兩種,血漿水平很低,目前很難檢測到。其中,IL-1β在腦缺血過程中的作用尤為重要。它是一種重要的內源性致熱源,被認為在炎癥和急性期反應中發揮作用。動物實驗表明,IL-1β mRNA在腦缺血后10～30 min就可以檢測到,蛋白的增多在幾個小時之后[7]。同時,有報道稱,在大鼠20 min短暫性全腦缺血模型發生后,IL-1β mRNA及其蛋白表達是雙相的。即不僅在灌注早期(1 h),同時也發生在稍后(6～24 h)[7]。IL-6是免疫及神經系統中參與炎癥反應及細胞生長分化的重要細胞因子。IL-6曾被廣泛認為是促炎介質,但其在腦缺血中起多大作用尚不清楚。動物實驗表明,IL-6缺失小鼠與野生型的小鼠具有相似大小的梗死面積,從而認為IL-6不參與腦缺血損傷的病理過程[8]。IL-10被認為是抗炎細胞因子,可以抑制 IL-1、TNF-α及細胞因子受體的激活,在中樞神經系統被激活,實驗性腦缺血模型中可以觀察到其水平的升高,體外注射及基因轉化都表明其具有腦缺血保護功能。

2.2 腫瘤壞死因子(TNF-α) 它是在炎癥和免疫系統中具有多種生物活性的多肽。在腦缺血損傷的過程中,是一種促炎介質。Rothwell等稱之為“原型炎癥細胞”。動物實驗發現,它在腦缺血發生后很快就可以產生。最早在腦缺血后1～3 h表達,也是雙向的,第2次高峰出現在24～36 h[9]。表達TNF-α的細胞由過去認為的神經元到小膠質細胞及星型膠質細胞,目前認為外周的免疫細胞也有表達[10]。也有報道認為TNF-α在某些特定情況下具有保護作用,保護作用機制可能與免疫耐受有關。造成這種差別的原因可能是由于其信號的不同傳導途徑。

2.3 黏附分子 主要在內皮細胞、白細胞等細胞表面表達。在腦缺血后白細胞浸潤腦實質中起關鍵作用。主要分為3類:選擇素家族(P選擇素,E選擇素,L選擇素);免疫蛋白超家族(如ICAM-1,2等和VCAM-1);整合素等。選擇素家族介導細胞與細胞黏附及白細胞在毛細血管后微靜脈內皮的滾動。一旦被刺激物如凝血酶或者組胺激活,就立刻在細胞外膜表達。在早期階段,E選擇素及P選擇素參與白細胞的滾動和募集,L選擇素與未激活白細胞的引導有關。ICAM-1持續低劑量表達在內皮細胞、白細胞、上皮細胞及纖維母細胞表面,研究表明,ICAM-1在腦缺血發生后數小時內就可以出現,并在12～24 h達到高峰。也有報道,用雄性Wistar大鼠造模缺血2 h再灌注后發現,ICAM-1 RNA在缺血發生后1 h出現,蛋白水平的增高,在再灌注后46 h到達高峰,并且可以持續1周[11]。

3 基質金屬蛋白酶(MMPs)及細胞外基質

MM Ps被認為是能夠降解細胞外基質的一類蛋白。與細胞外基質的重塑及神經炎癥反應相關。經過組織型纖溶酶原激活物(tPA)治療,隨著 MMP-9的激活,血腦屏障的成分被降解[12]。MMPs通常在靜息狀態,與血纖維蛋白溶酶一起激活。在實驗性腦缺血模型中,MMP抑制劑可以減少腦梗死體積,減輕腦水腫和腦出血[13]。MMP-9已經被證實參與腦缺血損傷,接受M MP-9缺失骨髓移植后的小鼠要比那些接受正常MMP-9水平骨髓移植的小鼠損傷及血腦屏障破壞小[14]。

4 腦缺血炎癥相關的治療對策

目前對抗實驗性腦缺血炎癥的治療也在探索中,實驗性的干預被認為可以通過抗炎劑(包括對白細胞、黏附分子及受體、細胞因子產物等)及傳統醫學中的針刺治療等保護腦組織的缺血半暗帶。

4.1 中性粒細胞 在短暫性腦缺血模型中,一些研究表明一旦中性粒細胞的浸潤被阻止,就可以縮小腦梗死的體積[15]。

4.2 黏附分子 相關研究表明,ICAM-1阻滯劑或者用反義寡核苷酸阻滯ICAM-1 mRNA可以明顯改善實驗性腦缺血的結果[16]。不僅是ICAM-1的抑制劑,而且一氧化氮供體可以阻滯腦缺血再灌注損傷后ICAM-1 mRNA誘導的增加,從而起到神經保護作用[17]。在腦缺血后的大鼠和小鼠側腦室內注射抗VCAM-1抗體,結果表明,并不能改善大鼠的神經功能評分及2 d之后的腦梗死體積,對4 d后小鼠的梗死體積也沒有影響,從而得出結論:抗VCAM-1抗體對腦缺血后大鼠及小鼠沒有保護作用[18]。

4.3 細胞因子產物等 IL-1有幾種拮抗劑IL-1ra、caspase-1抑制劑、可溶性受體等;TNF-α有腫瘤壞死因子轉化酶(TACE)抑制劑、可溶性受體、抗體;前列腺素包括環氧化酶(COX)抑制劑;一氧化氮有iNOS抑制劑;補體有補體拮抗劑;系統炎癥主要包括他汀類。

4.4 針刺 在對抗腦缺血炎癥效果方面療效顯著。郭永明等觀察“醒腦開竅”針法對局灶性腦缺血大鼠腦組織及血清IL-1β含量的影響。針刺治療后,6 h～48 h腦組織IL-1β含量較同時段缺血組顯著降低,因此“醒腦開竅”針法能抑制缺血區腦組織IL-1β的合成和分泌,從而減輕由IL-1β引發的一系列腦缺血損害,發揮腦保護作用[19]?？琢⒓t等探討與炎癥密切相關的NF-κ B和腫瘤壞死因子活性在腦缺血灌注大鼠海馬表達的規律及電針干預對它的影響,電針能抑制其活化,減輕腦缺血再灌注時的炎癥反應,發揮神經保護作用[20]。

5 小結與展望

各個炎癥因子和基質金屬蛋白酶之間不是單獨發揮作用,而是組成一個復雜的免疫調節網絡,互相調節,互相平衡,維持靜態和動態的穩定。TNF-α和IL-1β作為兩個重要的促炎性細胞因子,主導缺血再灌注損傷的病理生理過程,在腦缺血過程中都是雙向表達,上調黏附分子如ICAM-1的表達,黏附分子表達又進一步啟動下游的一系列炎癥反應。IL-6可由IL-1、TNF-α誘導產生,IL-1和 TNF-α又可以互相誘導。IL-1、IL-6、TNF-α可以上調MMP-9,由此構成復雜的網絡調節體系。

腦缺血后炎癥反應是多種細胞,微血管及其產物最終發生協調作用的結果。早期的反應多是有益的,但持續過激的反應常常有害。目前對于缺血后各種信號的表達、轉導及傳遞的過程的了解及對炎癥細胞因子的抑制劑都處在探索階段或者動物實驗階段,炎癥的調節是一個復雜的調控系統,不是作用于單一的因素就可以完全阻滯其下游信號的傳遞,對一個信號的抑制有可能會導致另一個相似作用信號傳導的代償增強。整體的調節,注重整體觀念和辨證論治的傳統醫學比如針刺等手段,可以對治療腦缺血起到輔助治療作用。因此結合各種治療方法,聯合應用,可能對改善腦缺血的預后,減少腦梗死面積有幫助。

[1]Del ZG.Inflammation and the neurovascular unit in the setting of focal cerebral ischemia[J].Neuroscience,2009,158(3):972-982.

[2]Watanabe H,Abe H,Takeuchi S,et al.Protective effect of microglial conditioning medium on neuronal damage induced by glutamate[J].Neurosci Lett,2000,289(1):53-56.

[3]Schroeter M,Jander S,Huitinga I,et al.Phagocytic response in photochemically induced infarction of rat cerebral cortex.The role of resident microglia[J].Stroke,1997,28(2):382-386.

[4]Stevens SL,Bao J,Hollis J,et al.The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice[J].Brain Res,2002,932(1-2):110-119.

[5]Zheng Z,Yenari M A.Post-ischemic inflammation:molecular mechanisms and therapeutic implications[J].Neurol Res,2004,26(8):884-892.

[6]Li GZ,Zhong D,Yang LM,et al.Expression of interleukin-17 in ischemic brain tissue[J].Scand J Immunol,2005,62(5):481-486.

[7]Davies CA,Loddick SA,Toulmond S,et al.The progression and topographic distribution of interleukin-1 beta expression after permanent middle cerebral artery occlusion in the rat[J].J Cereb Blood Flow Metab,1999,19(1):87-98.

[8]Clark WM,Rinker LG,Lessov NS,et al.Lack of interleukin-6 expression is not protective against focal central nervous system ischemia[J].Stroke,2000,31(7):1715-1720.

[9]Murakami Y,Saito K,Hara A,et al.Increases in tumor necrosis factor-alpha following transient global cerebral ischemia do not contribute to neuron death in mouse hippocampus[J].J Neurochem,2005,93(6):1616-1622.

[10]Offner H,Subramanian S,Parker SM,et al.Experimental stroke induces massive,rapid activation of the peripheral immune system[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(5):654-665.

[11]Zhang RL,Chopp M,Zaloga C,et al.The temporal profiles of ICAM-1 protein and mRNA expression after transient MCA occlusion in the rat[J].Brain Res,1995,682(1-2):182-188.

[12]Kelly MA,Shuaib A,Todd KG.Matrix metalloproteinase activation and blood-brain barrierbreakdown following thrombolysis[J].Exp Neurol,2006,200(1):38-49.

[13]Pfefferkorn T,Rosenberg GA.Closure of the blood-brain barrier by matrix metalloproteinase inhibition reduces rtPA-mediated mortality in cerebral ischemia with delayed reperfusion[J].Stroke,2003,34(8):2025-2030.

[14]Gidday JM,Gasche YG,Copin JC,et al.Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,289(2):H558-H568.

[15]Garau A,Bertini R,Colotta F,et al.Neuroprotection with the CXCL8 inhibitor repertaxin in transient brain ischemia[J].Cytokine,2005,30(3):125-131.

[16]Vemuganti R,Dempsey RJ,Bowen KK.Inhibition of intercellular adhesion molecule-1 protein expression by antisense oligonucleotides is neuroprotective after transient middle cerebral artery occlusion in rat[J].Stroke,2004,35(1):179-184.

[17]Khan M,Jatana M,Elango C,et al.Cerebrovascular protection by various nitric oxide donors in rats after experimental stroke[J].Nitric Oxide,2006,15(2):114-124.

[18]Justicia C,Martin A,Rojas S,et al.Anti-VCAM-1 antibodies did not protect against ischemic damage either in rats or in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2006,26(3):421-432.

[19]郭永明,梁憲如,杜元灝,等.醒腦開竅針法對局灶性腦缺血大鼠腦組織及血清IL-1β含量的影響[J].上海針灸雜志,2004,(8):35-37.

[20]孔立紅,劉勝洪,毛娟娟,等.電針對腦缺血大鼠 NF-κ B及TNF-α表達的影響[J].中國康復醫學雜志,2009,(8):711-714.