亮葉楊桐葉總類黃酮的提取工藝優化及對肺腺癌細胞A549生長的影響

戰 宇，曾慶祝，方 玲

(廣州大學化學化工學院，廣東 廣州 510006)

亮葉楊桐葉總類黃酮的提取工藝優化及對肺腺癌細胞A549生長的影響

戰 宇，曾慶祝，方 玲

(廣州大學化學化工學院，廣東 廣州 510006)

采用響應面法對亮葉楊桐葉中類黃酮物質的提取工藝條件進行優化。結果表明，提取時間10min、乙醇體積分數63%、提取溫度70℃、比料液1:20時，亮葉楊桐葉中總類黃酮提取率為(95.58±0.49)%。采用MTT法對亮葉楊桐葉類黃酮抗肺腺癌細胞A549生長的活性進行研究，結果顯示亮葉楊桐葉類黃酮對肺腺癌細胞A549具有良好的抑制作用，并呈現顯著的時間效應和劑量效應關系。

亮葉楊桐；類黃酮；提取條件；生理活性

亮葉楊桐(Adinandra nitida Merr. Ex H. L. Li)是一種主要分布于我國廣西、廣東和貴州等省區的天然野生植物資源，以其鮮嫩葉制成的代茶——石崖(芽)茶在華南民間有著悠久的飲用歷史，具有消炎、解毒、降壓、退熱、止血、殺菌、鎮痛等多種功能[1]。近年來研究發現，亮葉楊桐富含以芹菜素為苷元的類黃酮，主要為山茶苷A[2]，其次含有少量的山茶苷B及芹菜素，總量可達28.4%[3]。藥理學研究證明，芹菜素具有抗高血壓、抗炎癥、抗潰瘍、抗HIV的活性，其中抗腫瘤作用最為突出[4-6]。因此，從廉價易得的亮葉楊桐葉中制備高附加值的黃酮類化合物，深度開發和高效利用豐富的亮葉楊桐植物資源，對促進華南山區經濟發展具有重要的現實意義。本實驗采用響應面試驗設計(response surface method，RSM)對亮葉楊桐葉中總黃酮的提取工藝條件進行優化，并采用MTT法對亮葉楊桐葉中所含的類黃酮的抗腫瘤活性進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亮葉楊桐干葉：2008年春購于廣西省來賓縣，粉

碎后過50目篩備用；芹菜素(純度98%) 陜西慧科植物開發有限公司；山茶苷A(純度98%以上) 實驗室自制；肺腺癌細胞A549 美國ATCC公司；DMEM培養基(含25mmol/L Hepes緩沖液、60mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素以及2g/L碳酸氫鈉)、RPMI 1640培養基、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜 美國Sigma公司；胎牛血清Gibco公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TA2004電子天平 上海天平儀器廠；752紫外-可見分光光度計 上海精密儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器公司；SHZ-D(Ⅱ)循環水式真空泵 鞏義市英裕予華儀器廠；DHG-9000A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博訊公司醫療設備廠；Elisa酶標儀TECAN公司。

1.3 亮葉楊桐葉總類黃酮提取工藝參數的優化

1.3.1 溶劑的選擇

實驗發現用水做溶劑時，溶劑用量大，固形產品回收困難，特別是在較高溫度時，雜質含量大，不但影響產品純度而且過濾困難。乙醇作為溶劑時對類黃酮化合物具有較好的溶解性，不易引入較多雜質。甲醇作溶劑提取率與乙醇相差不大，但甲醇容易揮發且有毒，因此本實驗采用乙醇作為提取溶劑。

1.3.2 單因素試驗

提取溫度、乙醇體積分數、提取時間、液固比、提取次數5個因素會影響總類黃酮的提取率?？紤]到乙醇的沸點及成本，設定提取溫度變化范圍為30～70℃，乙醇體積分數為40%～100%；提取次數為1次。為確定提取時間與液固比的變化范圍，實驗考察上述因素對提取率的影響。

類黃酮化合物提取率/%＝(提取出的類黃酮化合物的質量/亮葉楊桐中含有的類黃酮化合物的質量)×100。已用體積分數80%乙醇溶液對亮葉楊桐葉進行10h索氏提取，紫外分光光度法測得類黃酮化合物含量為(31.84 ±0.42)%。提取液的類黃酮化合物的質量，通過紫外分光光度法在330nm波長處測定吸光度，再用以山茶苷A為標樣制作的標準曲線計算而得。標準曲線回歸方程：y＝31.348x－0.976，R2＝0.9982。

1.3.3 響應面試驗

采用Design-Expert 7.0中的響應面試驗設計法，設計4因素共30個試驗點，24個析因點，6個中心點。

1.4 亮葉楊桐葉類黃酮抗腫瘤活性的研究

1.4.1 亮葉楊桐葉類黃酮溶液的制備

稱取一定量的亮葉楊桐干葉，在優化的工藝條件下提取總類黃酮，所得提取液抽濾后，在40℃的條件下真空旋轉濃縮，蒸去乙醇后的殘余物冷凍干燥，所得固態產品測定總類黃酮含量為(31.84±0.42)%，山茶苷A含量為(27.57±0.92)%，以蒸餾水溶解，備用。

1.4.2 細胞培養

A549細胞分別接種于RPMI 1640培養基和含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37℃、5% CO2孵育，每周傳代2次。取對數生長期細胞進行實驗。

1.4.3 MTT實驗

將A549細胞接種于96孔培養板中，每孔細胞密度為2×104/mL，分別加入終質量濃度為20、10、2.5、1.25、0.625mg/L的亮葉楊桐葉類黃酮溶液，分別培養24、48、72h。對照組則加入培養液，每組各設3個復孔。每孔加入1μg/mL MTT各100μL，避光、37℃、5% CO2條件下繼續孵育4h后終止培養。將培養板于1100r/min離心5min，棄去上清液。每孔加入200mL DMSO，振蕩15min，使結晶物充分溶解。將培養板置于酶標儀上，測定各孔在570nm和630nm處的光密度值，計算亮葉楊桐葉總類黃酮對A549細胞的細胞抑制率，繪制生長抑制曲線。采用DPS9.5軟件包中連續變量的概率單位分析法，計算亮葉楊桐葉類黃酮對A549細胞的半數抑制濃度(50% concentration of inhibition，IC50)[7]。

細胞抑制率/% ＝(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100

2 結果與分析

2.1 提取時間對亮葉楊桐葉總類黃酮提取率的影響

圖1 提取時間對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida

如圖1所示，在提取溫度50℃、液固比20:1、乙醇體積分數80%條件下，改變提取時間研究其對提取率的影響。結果表明，當提取時間超過10min后，提取率上升趨緩，這說明亮葉楊桐葉類黃酮的提取是一個非常迅速的過程，因此RSM實驗中的提取時間變化范圍設定為10～40min。

2.2 液固比對亮葉楊桐葉總類黃酮提取率的影響

如圖2所示，在提取溫度50℃、提取時間15min、乙醇體積分數80%條件下，改變液固比觀察其對提取率的影響。結果表明隨著液固比的增大，提取率迅速上

升，當液固比超過20:1時，提取率上升趨緩，而當液固比低于10:1(mL/g)時，提取操作不便，因此將RSM實驗中液固比的變化范圍設定為10:1～30:1(mL/g)。

圖2 液固比對提取率的影響Fig.2 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida

2.3 亮葉楊桐葉總類黃酮提取工藝參數的優化

表1 響應面試驗因素及其取值范圍Table1 Factors and levels in response surface design

表2 響應面試驗設計及結果Table2 Response surface design layout and experimental results

表3 響應面試驗方差分析Table3 Variance analysis for extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida with various extraction conditions

表1為響應面試驗驗因素及其變化范圍，表2為響應面試驗設計及結果。

表3為響應面試驗的方差分析結果，在選定的試驗范圍內，提取時間和液固比對提取率的影響不顯著(P值分別為0.9982、0.2082)。水浴溫度和乙醇體積分數對提取率的影響顯著(P=0.001)，且水浴溫度和乙醇體積的交互作用對提取率也有影響(P=0.0739)。

將實驗結果按標準二次項多項式回歸，回歸方程為：提取率＝1.04342－0.21570A＋0.35430B＋2.11642C＋1.67033D－4.57708×10-3AB－2.98750×10-3AC＋ 5.48472× 10-3AD－0.012228BC＋4.83437×10-3BD＋3.29375×10-3CD＋2.40312×10-3A2＋3.89254×10-4B2－0.036843C2－0.016888D2

由圖3各單因素對亮葉楊桐葉總類黃酮提取率的影響可知，當提取時間超過10min后提取率上升趨緩，這與單因素試驗結果相符，充分說明本實驗中類黃酮的提取是一個非常迅速的過程。呂麗爽等[8]在研究蘆蒿中黃酮類化合物提取時也曾出現這種現象。本實驗的提取時間如此之短可能是由于以下原因：①粉碎后，物料粒度較細，表面積增大，且植物組織結構遭到了一定的破壞；②乙醇是一種穿透細胞壁很強的溶劑；③物料中類黃酮含量很高，提取時內外濃度差高，有利于縮短提取時間。

提取溫度對提取率的影響：隨著提取溫度升高，分子運動速度加快，溶劑黏度降低，其滲透、溶解、擴散速度加快，所以在不超過溶劑沸點的前提下，隨著提取溫度升高提取率會逐漸上升。

液固比對提取率的影響：隨著液固比的增大，可降低提取液的濃度，有利于可溶成分從細胞內向細胞外擴散，但當液固比超過20:1時，提取率無顯著變化。

圖3 單因素對提取率的影響Fig.3 Single-factor investigations into the effects of various extraction conditions on extraction rate of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida

乙醇體積分數對提取率的影響：當乙醇體積分數高于40%時，隨著乙醇體積分數的增大類黃酮的提取率增加，當乙醇體積分數達到60%左右時，類黃酮在溶劑中的溶解度最大、提取率最高，隨著乙醇體積分數的繼續增加，類黃酮提取率下降，這可能是由于一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭與乙醇分子結合，導致類黃酮的提取率下降。這與張德權等[9]報道的60%左右體積分數的醇類適于提取類黃酮苷類的結論一致。

進一步使用Design-Expert 7.0優化類黃酮提取條件，經典型性分析獲得的總類黃酮提取最適工藝條件為提取時間10min、乙醇體積分數63.04%、水浴溫度70℃、液固比19.58，理論總黃酮得率為99.64%?？紤]到實際操作的可行性和便利性將提取工藝條件修正為提取時間10min、乙醇體積分數63%、提取溫度70℃、料液比20:1，經3次實驗確認，亮葉楊桐葉總類黃酮的實際得率為(95.58±0.49)%。

2.4 亮葉楊桐葉類黃酮抗腫瘤活性的研究

圖4 亮葉楊桐葉類黃酮對肺腺癌細胞A549增殖的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida on the proliferation of lung cancer A549 cells

如圖4所示，亮葉楊桐葉類黃酮對肺腺癌細胞A549具有一定的抑制作用，20mg/L亮葉楊桐葉類黃酮作用72h后，對A549細胞的抑制率達到58.4%。且亮葉楊桐葉類黃酮對A549細胞的抑制作用呈現顯著的時間－效應和劑量—效應關系。同一作用濃度下，隨作用時間的延長亮葉楊桐葉類黃酮抑制A549細胞的效果也越好；而在作用時間相同的情況下，亮葉楊桐葉類黃酮濃度越高則對A549細胞抑制率也越高。當作用時間為72h時，亮葉楊桐葉類黃酮對A549細胞的IC50為13.5μmol/L。

從細胞形態上觀察，未添加亮葉楊桐葉類黃酮的對照組細胞生長良好，細胞大小均勻，形態一致，胞質豐富，死細胞較少。而在加入亮葉楊桐葉類黃酮化合物72h后，腫瘤細胞數量明顯減少，細胞大小不一，細胞核固縮，胞質減少，死細胞較多。表明亮葉楊桐葉類黃酮對A549細胞具有一定的抑制作用。

文獻資料[10-15]顯示黃酮類化合物所具有的抗腫瘤活性可能的作用機理包括抑制蛋白酶體、抑制脂肪酸合成、抑制拓撲異構酶、抑制磷脂酰肌醇3-激酶、誘導細胞周期阻滯、累積腫瘤抑制基因p53及增強原癌基因c-fos和c-myc的表達等。亮葉楊桐葉類黃酮抑制肺腺癌細胞A549生長的具體生理機理有待于進一步研究。

3 結 論

采用響應面試驗設計，以粉碎的亮葉楊桐葉為原料、乙醇-水為溶劑，恒溫振蕩提取總類黃酮的最適工藝條件為：提取時間10min，乙醇體積分數63%，提取溫度70℃，料液比1:20，總類黃酮得率為(95.58± 0.49)%。采用MTT法對亮葉楊桐葉中類黃酮物質抗肺腺癌細胞A549生長的活性進行了研究，結果顯示亮葉楊桐葉類黃酮對肺腺癌細胞A549具有良好的抑制作用，作用72h時的IC50為13.5μmol/L，具體的抑制機理有待于進一步研究。

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Optimization of Total Flavonoids Extraction from the Leaves of Adinandra nitida and Their Inhibitory Effect on Lung Cancer A549 Cells

ZHAN Yu，ZENG Qing-zhu，FANG Ling
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

Adinandra nitida is a traditional Chinese herb for health drink, of which leaves are rich in flavonoids. The optimization of total flavonoids extraction from the leaves of Adinandra nitida with ethanol as the extraction solvent was conducted in this work, which was also aimed at examining if the total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida have the ability to inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells. The optimal extraction conditions of total flavonoids from Adinandra nitida leaves were determined by response surface methodology to be: extraction time, 10 min; ethanol concentration, 63%, extraction temperature, 70 ℃; and material/liquid ratio, 1:20. The extraction rate of total flavonoids was (95.58 ± 0.49) % under the optimal extraction conditions. The inhibitory effect of the total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida on the proliferation of lung cancer A549 cells was evaluated by MTT assay. The total flavonoids could significantly inhibit the proliferation of lung cancer A549 cells in significant time-dependent and dose-dependent manners.

Adinandra nitida；total flavonoids；extraction condition；physiological function

TQ91

A

1002-6630(2010)22-0006-05

2010-01-17

廣州市科技局項目(2006J1-C0251)；廣州大學食品加工與安全重點實驗室資助項目(2010)

戰宇(1974—)，女，講師，博士，主要從事天然產物及其開發研究。E-mail：yuzhan@scut.edu.cn