三種致病菌粗脂多糖（LPS）對團頭魴的免疫原性

胡火庚 汪成竹 陳昌福

三種致病菌粗脂多糖（LPS）對團頭魴的免疫原性

胡火庚 汪成竹 陳昌福

胡火庚，江西省水產技術推廣站，高級工程師，330046，江西 南昌。

汪成竹，河南省信陽農業高等?？茖W校。

陳昌福，華中農業大學水產學院。

★ 農業公益性行業科研專項經費項目（200803013）和973項目（2009CB118700）資助

國內外大量研究表明，從革蘭氏陰性菌中提取的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對養殖魚類具有比較強的免疫原性和良好的免疫保護作用。Kawai等（1987）采用溫酚法從鰻弧菌（Vibrio anguillarum）中提取的菌體LPS接種香魚（Plecoglossus altiveliss）后能使受免魚得到良好的免疫保護力。Salati等（1984）的研究證實，從遲緩愛德華菌（Edwardsilla tarda）中提取的菌體LPS對日本鰻鱺（Anguilla japonica）具有良好的免疫原性。陳昌福等（1997）先后利用從魚類多種致病菌中提取的粗LPS分別免疫接種鯉（Cyprinus carpio）、草魚（Ctenopharyngodon idellus） 和鱖（Siniperca chuatsi）等養殖魚類，均獲得了比較好的免疫效果。黃辨非等（2002）采用溫酚法從鰻弧菌（V.anguillarum）、哈維弧菌（V.harveyi）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的菌體中提取的粗LPS分別接種異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）后，比較了3種致病弧菌菌體粗LPS對異育銀鯽的免疫原性的差別。

隨著網箱飼養團頭魴（Megalobrama amblycephala）的迅速發展，各種傳染性疾病的發生越來越頻繁，依靠藥物有效控制團頭魴各種傳染性疾病的難度也越來越大。本研究利用從患病團頭魴體內分離的柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria），分別提取其菌體LPS后，對網箱飼養的團頭魴進行了免疫接種試驗，旨在為研制預防團頭魴的魚用疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及其培養

用于本研究的柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌由江西省南昌縣某水產養殖場飼養的患病團頭魴體內分離得到。將保存的菌種先在腦心浸液培養基（BHI，Difco產品）中 25℃條件下，預培養 24 h，再轉接種于淡水瓊脂培養基（FWA）中，培養48 h后，離心集菌并以滅菌生理鹽水清洗3次，稀釋菌液至一定的濃度，加入終濃度為0.5%的福爾馬林，冷藏備用。

1.1.2 菌體粗LPS的提取

參照Westphal等（1965）的方法分別從柱狀黃桿菌、嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌3種供試菌中提取粗 LPS（分別簡稱為 fc-LPS、ah-LPS 和 as-LPS）。

1.1.3 供試魚

供試魚飼養于武漢市洪山區湯遜湖的網箱中，網箱規格為3.0m×3.0m×2.0m。每個網箱內放養500尾，平均體重為324.0 g。

1.2 方法

1.2.1 試驗魚分組與飼養管理

從環境條件大致相同、同一個魚排的30個相同規格網箱中隨機選取4個網箱（分別作為Ⅰ～Ⅳ組）用于本試驗。在開始試驗前，利用過篩法從全魚排網箱飼養的團頭魴中選擇規格相近的魚體放于擬做試驗的4個網箱中。每天投喂相當于魚體重3.0%的飼料，早、晚各1次。所用飼料為武漢海大飼料公司生產的團頭魴專用飼料。試驗期間溫度變化于18.5～27.5℃之間。

1.2.2 免疫接種

用滅菌生理鹽水分別將3種菌體粗LPS調整至5.0mg/ml的濃度后，按25.0mg/kg魚體重的接種量，以注射法經供試魚的胸鰭基部接種，每1種菌體LPS溶液各注射500尾供試魚放入同一個網箱，分別作為3個試驗組。另外以注射大致相同劑量生理鹽水的500尾團頭魴，放入另一個網箱內作為對照組。

1.2.3 采血

分別于免疫接種后第7、14、21和28 d，從每個試驗組和對照組網箱中分別隨機抽取15尾魚采血。將每尾魚的血液均分為2份，1份置常溫下凝血后分離血清，供檢測凝集抗體效價和交叉凝集抗體效價用；另1份以肝素抗凝，供分離白細胞測定其吞噬活性之用。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 凝集抗體效價的測定

采用血凝板依常法進行。反應抗原分別采用經福爾馬林滅活的F.columnare（簡稱F-FC）、A.hydrophila（簡稱 F-AH）和 A.sobria（簡稱 F-AS）。

1.3.2 吞噬活性的測定

對采血后的供試魚立即解剖，取出頭腎，在L-15培養基（Difco產品）中用滅菌剪刀將頭腎剪碎，再用白金網過濾，去除組織塊。以600 r/min離心10min，將濾液中的細胞清洗3次后，離心回收細胞并用L-15培養基將細胞濃度調整至1.0×105個細胞/ml，作為頭腎吞噬細胞液；將抗凝血以600 r/min的速度離心5min，分離收集白細胞層，用L-15培養基調整細胞濃度至1.0×105個細胞/m l，作為血液中吞噬細胞液。分別在0.5m l頭腎和血液吞噬細胞液中添加0.2 m l經福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，簡稱F-SA），置25℃水浴中孵育40 min后，涂片，Giemsa染色，鏡檢。依照下式計算各種吞噬細胞的吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指數（phagocytic index，PI）。

1.3.3 殺菌活性的測定

參照陳昌福（1997）的方法進行。即在盛有0.5ml頭腎或血液吞噬細胞液的試管中分別添加0.2 ml A.hydrophila活菌，在25.0℃水浴中孵育40min后，加入1.0ml L-15培養基，以600 r/min離心10min的方法清洗吞噬細胞3次，棄上清后再添加0.3ml 0.2%的Tween 20（Difco產品）水溶液并搖動5min，使吞噬細胞破碎，加入2.0ml BHI，在25℃培養箱中培養16 h，每支試管中加入0.05 ml濃度為5.0 mg/ml的MTT（Monotetrazolium，日水產品）溶液，搖動15 min后用751分光光度計于600 nm處測定光密度值，并且依下式評價受免和對照魚的吞噬細胞對A.hydrophila活菌的殺菌活性（bactericidalactivity，BA）。

殺菌活性（BA）＝

試驗魚吞噬細胞還原的MTT的光密度值。

對照魚吞噬細胞還原的MTT的光密度值

2 結果與分析

2.1 凝集抗體效價

受免和對照團頭魴血清中凝集抗體效價和交叉凝集抗體效價的測定結果如表1所示。從表1可以看出，用3種不同的菌體粗LPS注射接種團頭魴后，受免魚血清中凝集抗體效價和交叉凝集抗體效價均迅速地上升，各受免組團頭魴血清中的凝集抗體效價和交叉凝集抗體效價均于接種后第14 d內達到高峰，隨后逐漸下降，而對照組團頭魴血清中的凝集抗體效價和交叉凝集抗體效價都很低。受免組和對照組團頭魴血清中的凝集和交叉凝集抗體效價水平具有極顯著差異（P＜0.01），而3 個免疫組之間則差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 血液和頭腎中吞噬細胞的吞噬活性

受免和對照團頭魴血液和頭腎中吞噬細胞對FSA的吞噬活性測定結果如表2所示。由表2可以看出，采用3種不同的菌體粗LPS注射接種團頭魴后，多數受免魚血液和頭腎中吞噬細胞的PP和PI逐漸上升，并且總的趨勢是于免疫接種后14 d左右達到峰值，受免魚血液和頭腎中吞噬細胞的PP和PI值，均極顯著地高于對照組（P＜0.01）。

表1 受免和對照團頭魴血清中凝集抗體效價和交叉凝集抗體效價

表2 受免和對照團頭魴血液和頭腎中吞噬細胞對F-SA的吞噬活性

2.3 血液和頭腎中吞噬細胞的殺菌活性（見表3）

對受免和對照團頭魴血液和頭腎中吞噬細胞的殺菌活性的測定結果如表3所示。由表3可以看出，經3種不同菌體粗LPS注射接種團頭魴后，受免團頭魴血液和頭腎中吞噬細胞的殺菌活性均顯著地高于對照組（P＜0.05），但是各免疫組之間的差異則不顯著（P＞0.05）。

表3 受免和對照團頭魴血液和頭腎中吞噬細胞的殺菌活性

3 討論

關于魚類致病菌菌體粗LPS對魚類免疫原性的研究已有較多報道。但是，除黃辨非等（2002）對異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）的研究中注意到了3種弧菌的LPS存在共同抗原外，其他的研究者尚未注意到各種魚類致病菌菌體粗LPS上的共同抗原問題。

陳昌福等（2000）的研究證明，當對鱖（Siniperca chuatsi）接種F.columnare或者遲緩愛德華菌（E.tarda）的菌體粗LPS后，受免魚能增強對A.hydrophila活菌攻毒的抵抗力。在本研究中，經接種3種不同細菌的菌體粗LPS后，受免團頭魴的血清中均產生了不同水平的交叉凝集抗體效價，說明在3種細菌的菌體粗LPS上存在著一定數量的共同抗原，并且這些共同抗原對供試魚具有較強的免疫原性。至于這些共同抗原能否誘導受免魚類產生交叉免疫保護力，尚有待進一步研究。

對魚類接種疫苗后觀察其免疫應答水平時，大多數研究者是將試驗魚飼養在人工控制的實驗室水族箱中進行的，但是，實驗室內過多的人為因素對實驗魚造成的各種脅迫，對實驗魚免疫應答過程的影響往往是研究者難以預測和準確評估的。本研究中將試驗魚飼養在野外的生產性網箱中進行，雖然難以完全避免人為因素對試驗魚免疫應答過程的影響，但是，如果采用本試驗結果評估魚用疫苗在實際生產中的應用狀況，就可能因為有效地減少了試驗誤差而更為準確。

12篇，刊略，需者可函索）

（編輯：沈桂宇，guiyush@126.com）

2010-02-22