雙向凝膠電泳技術在中醫證候研究中的應用

陳 冰

(中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京市東直門內南小街 16號，100700)

雙向凝膠電泳技術自從問世以來便廣泛應用于各種領域，現已成為蛋白質組學的核心技術，由于其整體性、實時性等特點，近年來大量應用于中醫證候研究方面。本文擬對雙向電泳技術在證候研究中的應用做一綜述。

1 雙向電泳技術原理及應用

雙向電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是根據蛋白質等電點和分子量的不同，通過兩次方向互相垂直的高分辨率等電聚焦電泳和十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，將帶不同凈電荷和不同分子量的蛋白質二維平面上呈點狀分開的技術。雙向電泳技術 1975年由意大利生化學家O'Farrell發明[1]，可以在一個平面上分離出數以千計的蛋白質，適用于整體水平生命活動規律的研究[2]。它以高分辨率、簡單、快速等優點被廣泛應用于蛋白質組學研究，是目前分離復雜蛋白質組分最常用的工具。通過雙向電泳得到差異蛋白后，可結合其他蛋白質組學研究方法進一步分析，如結合質譜技術進行差異蛋白質的鑒定、相關數據庫檢索，將所獲結果進行生物信息學分析等。因此說，雙向電泳是蛋白質組學的核心技術。

雙向電泳技術包括蛋白樣品制備、等電聚焦、SDSPAGE、染色等步驟。樣品制備非常關鍵，合理的樣品制備可保證 2-DE的重復性。盡量減少蛋白提取過程中的降解和丟失，以提高分辨率。等點聚焦是在存在 p H梯度和電場的條件下，蛋白質分子向其凈電荷為零的 p H處移動，當樣本中的每一個蛋白質均達到其電荷為零的 pH位置時，樣品蛋白質就根據其等電點得到分離。SDS-PAGE有垂直和水平 2種方式。垂直方式是目前常用的電泳方式，陰離子去垢劑十二烷基磺酸鈉同蛋白質合后形成項鏈樣結構，并以 114∶1的比例結合，從而使蛋白質帶有凈負電荷，使蛋白電泳時移動距離與其分子量呈正比。

雙向電泳常用的染色方法有考染色、銀染、熒光染色等方法。熒光差異雙向凝膠電泳(DIGE)是目前蛋白質組學研究的熱門技術[3-4]。它是通過熒光染料與蛋白質中的賴氨酸殘基進行結合，把不同熒光素標記的樣品在同一塊凝膠上進行分離，用不同波長的激光激發后可以顯示不同的顏色。DIGE技術的優點是采用幾種不同的熒光染料(Cy3、Cy5、Cy2)分別標記不同的蛋白質樣品，并設立內標，可以在同一塊膠上同時分離 2種以上蛋白質樣品，比較同一蛋白在不同樣品中的豐度[5-6]。由于每塊凝膠中加入了內標，降低了普通雙向凝膠電泳中不同凝膠間的誤差，減少了實驗重復次數;且靈敏度高，可以對相對微量的蛋白質進行定量研究。DIGE實驗中一般用 Cy2標記內標，用 Cy3、Cy5分別交叉標記不同膠間的樣品，這就避免了不同染料對實驗結果的影響。其分析軟件能自動進行蛋白質點的識別和匹配，可消除人為因素，增加實驗的準確性和重復性[7-8]。因此，DIGE技術具有較高的敏感性、特異性及較寬的動態范圍等優點，非常適用于樣本數較少，蛋白豐度范圍大的實驗研究。目前已有學者將該項技術應用于證候特征的研究方面，唐利華等發現了 17個差異蛋白質可能與腎陽虛疾病有關[9]。雙向電泳技術還可以根據研究者的需要結合其他蛋白質組學相關技術，如蛋白質芯片、S質譜等，目前雙向電泳加質譜已經成為蛋白質組學研究的基本方法。

2 雙向電泳技術是研究中醫證候的重要方法

中醫證候是指在致病因素作用下，機體內外環境各系統之間相互關系發生紊亂所產生的綜合反應，是反映疾病處于某一階段病因、病性、病位、病勢等病理因素的綜合性診斷概念，是致病因素與機體反應兩方面情況的綜合。證，是指對疾病所處的一定階段的病機概括，或非疾病機體的一定階段的機體狀態的概括;候，是指這種病機或狀態的可被觀察到的外在表現[10]。

蛋白質組的概念最早由澳大利亞學者 Wilkins和Williams提出[11]，指由一個基因組、細胞、組織或生物所表達的全部蛋白質。蛋白質組學是以細胞或組織不同時間、環境的所有蛋白質為研究對象，從整體上研究蛋白質的種類、相互作用以及功能結構的一門科學。而證候的整體性、時相性等特點與蛋白質組學時空性與整體性的特點十分貼近。因此，應用蛋白質組學方法對證候本質進行研究已經成為一種公認的方法，而作為蛋白質組學中最重要的技術——雙向電泳，更是被廣泛使用。將蛋白組學引入證實質研究，更有利于動態地揭示同一個研究對象不同時期的變動性，更符合證研究自身的特點。對不同中醫證候產生前后蛋白質組學研究，探究中醫證候產生的物質基礎支配機制，可以揭示中醫證候的科學內涵，能夠為中醫診斷的客觀化提供依據和方法。尋找與證候相關的差異標志蛋白群，制定標準參照物，使得疾病的辨證分型及用藥具有客觀性、準確性及重復性[12]。

3 雙向電泳技術在中醫證候研究中的應用

以雙向電泳技術為代表的蛋白質組學方法近些年來已經大量應用于中醫證候的研究中。劉萍[13]等通過雙向電泳技術，成功建立了脾腎虛型重癥肌無力患者血清 2-DE圖譜。其中在正常對照組雙向電泳圖譜上觀察到了 1463±179個蛋白點，而重癥肌無力組共觀察到 1508±89個蛋白點。選取具有明顯差異的21個蛋白點進行質譜鑒定，共鑒定出 8種差異蛋白。趙慧輝[14]等采用雙向凝膠電泳結合基質輔助激光解析/電離 -飛行時間質譜對 8例心絞痛血瘀證患者血瘀證程度變化前后的血漿進行比較蛋白質組學研究，尋找心絞痛血瘀證相關蛋白。結果初步發現了 Clusterin、ApoA-I在血瘀證程度變輕后表達增加，而 Fibrinogenβchain、Vitamin D-Binding Protein、Haptoglobin βchain、Albumin isoform在血瘀證程度變輕后表達降低。譚秦湘等[15]以不同疾病組肝郁證患者和正常人的血清為樣本，采用雙向凝膠電泳分離蛋白質組分，通過分析比較正常組與肝郁證組血清蛋白質圖譜，探詢其物質基礎，經分析后發現肝郁證差異蛋白質群。張嫻[16]等在對自發性高血壓大鼠組和高血壓肝陽上亢模型組大鼠肝臟蛋白質組的雙向電泳分析中發現，大部分蛋白集中分布在 PI 5～8的區域。研究人員認為應用蛋白質組分析技術能較全面地了解模型的蛋白表達情況，有利于篩選證候相關蛋白，是研究中醫證候的可行途徑之一。戰麗彬[17]等應用雙向電泳技術，通過2-DE圖像分析軟件 ImageMaster 5.0對大鼠脾陰虛組和空白對照組海馬蛋白質組進行分析，可分辨 2組蛋白斑點數目分別為(2027±61)個和(1917±207)個。將圖譜部分區域放大后顯示出明顯差異，初步篩選出脾陰虛大鼠海馬蛋白質組的差異表達，研究人員推測與學習記憶相關。劉希成[18]利用雙向電泳優化分離了除去高豐度蛋白(白蛋白和 IgG)的老年體虛腎陽虛患者(以健康組為參照)的血清樣本，對比分析pH4～7范圍的 2-DE圖譜，發現腎陽虛患者和參照組的平均蛋白點分別為(393±32)和(455±19)個。其中腎陽虛證候表達量上調 2倍(P＜0.05)以上的蛋白點有 26個，下調 2倍以上的有 33個。結合質譜獲得上述差異蛋白的肽質量指紋圖譜，并經數據庫檢索共鑒定出了 49種差異蛋白質，其中有 10種在腎陽虛血清中特異表達，有 6種在健康組血清中特異表達。蛋白功能分析發現，其中 33種蛋白質的差異表達與腎陽虛證密切相關。蛋白質 TCRβ及 transthyretin的蛋白印跡實驗驗證了 2-DE的結果。研究人員認為該研究結果為闡明中醫腎陽虛證的機理提供了一條新途徑。除此之外，還有學者利用雙向電泳技術對血虛證[19]、慢性胃炎濕證[20]等證候類型進行了研究。

4 存在問題與展望

雙向電泳的分辨率較高，近年來被廣泛應用于農業、醫學等研究領域。但仍存在諸多問題:1)重復性差，自動化程度低;2)低豐度蛋白質、極酸及極堿性蛋白質、分子量過大或過小的蛋白質及膜蛋白等分離困難。針對上述問題，可采用如二維色譜、二維毛細管電泳、液相色譜 -毛細管電泳等新型分離技術作為雙向電泳的補充。而且隨著高通量和高精度蛋白質新型檢測技術的出現，雙向電泳技術可以得到進一步完善。雙向電泳技術結合蛋白質的生物質譜鑒定及其與生物信息學的結合一系列方法的建立，必將為中醫證候的研究提供更完備的支持。

[1]O'Farrell PH.High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[M].J Biol Chem，1975，250:4007-4021.

[2]Dutt MJ，LeeKH.Proteomics analysis.Curr Opin Biotechnol，2000，11(2):176-179.

[3]Zhou G，Li H，DeCamps D，et al.2D differential in2gel electrophoresis for the identification of esophageal scans cell cancer specific protein markers.Mol Cell Proteomics，2002，1(2):117-124.

[4]Gharbi S，Gaffney P，Yang A，et al.Evaluation of two2dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.Mol Cell Proteomics，2002，1(2):91-98.

[5]Unlu M，Morgan ME，Minden JS.Difference gel electrophoresis:a single gel method for detecting changes in protein extracts.Electrophoresis，1997，18(11):2071-2077.

[6]Tonge R，Shaw J，Middleton B，et al.Validation and development of fluorescence two2dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.Proteomics，2001，1(3):377-396.

[7]Karp NA，Kreil DP，Lilley KS.Determining a significant change in protein expressinon with DeCyder TM during a pair-wise comparison using two-dimensional difference gel electrophoresis.Proteomics，2004，69(4):1421-1432.

[8]Alban A，David SO，Bjordesten L.A novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis:Two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard.Proteomics，2003，68(3):36-44.

[9]唐利華，盧德趙，沃興德.腎上腺切除的腎陽虛大鼠肝組織蛋白質雙向電泳圖譜的建立與分析.浙江中醫學院學報，2005，29(5):51-54.[10]郭蕾，王永炎，張志斌.關于證候概念的詮釋.北京中醫藥大學學報，2003，26(02):5-8.

[11]Wasinger VC，Cordwell SJ，Cerpa-Poljak A，et al.Progress with geneproduct of mapping of the moliautos Mycoplasmit genitalium.Electrophoresis，1995，16(7):1090-1094.

[12]施孟如，沃興德，盧德趙.蛋白質組學和中醫藥研究.浙江中醫學院學報，2004，28(6):82-85.

[13]劉萍，章怡祎，喬健.脾腎虛型重癥肌無力患者血清雙向電泳圖譜的建立及分析.中西醫結合學報，2007，5(2):150-154.

[14]趙慧輝，王偉，李宏.雙向電泳 -質譜技術篩選心絞痛血瘀證相關蛋白的研究.北京中醫藥大學學報，2008，27(2):96-99.

[15]譚秦湘，呂志平，鐘小蘭，等.肝郁證辨證與相關蛋白關系初步研究.遼寧中醫雜志，2006，33(2):157-158.

[16]張嫻，曾星，段小軍，等.高血壓肝陽上亢證大鼠模型建立和蛋白質表達分析.四川中醫，2008，26(3):9-11.

[17]戰麗彬，劉莉，路小光，等.脾陰虛證大鼠海馬蛋白質組雙向凝膠電泳的研究.中華中醫藥雜志，2009，24(2):149-152.

[18]劉希成，梁恒，田真，等.腎陽虛證候的人血清比較蛋白質組學分析.中國生物化學與分子生物學報，2007，23(7):592-599.

[19]馬增春，高月，譚洪玲，等.四物湯對輻射致血虛證小鼠血清蛋白質表達的影響.中國中藥雜志，2003，28(11):1050-1053.

[20]王憶勤，李福鳳，王文靜，等.慢性胃炎中醫濕證血清蛋白組學研究.中西醫結合學報，2007，5(5):514-516.