農藥和化肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應研究進展

李貞，李丕鵬，徐齊艷，陸宇燕，*

1.沈陽師范大學中國兩棲爬行動物保護與繁育研究中心遼寧省生物進化與生物多樣性重點實驗室，沈陽110034

2.遼寧省腫瘤醫院，沈陽110042

農藥和化肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應研究進展

李貞1，李丕鵬1，徐齊艷2，陸宇燕1，*

1.沈陽師范大學中國兩棲爬行動物保護與繁育研究中心遼寧省生物進化與生物多樣性重點實驗室，沈陽110034

2.遼寧省腫瘤醫院，沈陽110042

以兩棲動物研究環境污染物的毒性效應進而監測環境的變化，已成為國內外的研究熱點.兩棲類的胚胎發育和變態過程對水的依賴性極強，而且鰓和皮膚有很強的滲透性，當其受到污染脅迫時，在細胞、組織及生理生化水平上都會發生顯著變化，進而會影響其存活和生長發育.在總結國內外相關研究基礎上，綜述和分析了農藥、化肥（氮肥）對無尾兩棲類蝌蚪的行為表現、生長發育、組織結構和生理生化變化等方面的毒性效應，以期為農藥、化肥的水環境監測及合理使用提供全面的科學依據.

蝌蚪；化肥；農藥；環境監測

近20年來，世界范圍內兩棲動物種群數目急劇減少及畸形蛙大量出現的現象提示水環境污染已成為威脅其生存的主要因素之一（Blaustein et al.,1994;Wake,1991;牛海崗等，2009）.水生毒理學的研究，以往主要集中在魚類和水生無脊椎動物，近年來的研究指出：無尾兩棲類的幼體——蝌蚪，由于其在變態前有外鰓暴露于水環境、其皮膚缺少保護結構致使具有較高的滲透性，水環境中的污染物能較快地在其體內大量富集，因此被廣泛用作指示生物進行水體有害物質及水質的監測，并取得了較好的效果（周景明等，2006;Stansley et al.,1992;Mann et al.,2009）.

近年來，隨著農產品需求量的不斷增加，農業生產中各種農藥和化肥的施用量也在不斷增加.由于產品劑型、施用方法及超量使用等原因，農藥、化肥在增產的同時也對環境帶來了嚴重的負面效應.利用無尾兩棲類蝌蚪研究農藥、化肥的毒性效應進而監測其對環境的影響，已成為近年來國內外研究的熱點（Hyaes et al.,2003;Ortiz-Santaliestra and Sparling,2007;De Wijer et al.,2003;呂秀芬，1989;南旭陽等，2000;苑宇哲等，2005;丁道韌等，1992;苗德志和李松梧，2007）.

本文以無尾兩棲類蝌蚪的活動行為、胚胎發育及生長發育、組織結構和生理生化變化等作為生物學指標，對農藥、化肥對其的毒性效應進行了綜述，以期為農藥、化肥的水環境監測及合理使用提供全面的科學依據.

1 農藥污染及其對蝌蚪的毒性效應

1.1 農藥污染源

目前我國農藥使用中存在的突出問題是使用不合理（王雪芳，2004），嚴重破壞了農業生態環境，主要表現在：1）大多數農藥直接噴灑于農作物表面，其中僅有10%左右藥劑被吸收，而大部分農藥則隨大氣流動或雨水流失.大氣中的農藥分子與人體皮膚和眼睛粘膜等接觸，或通過呼吸道吸入可引起疾病，嚴重的會導致急性中毒、慢性中毒，甚至致癌；有些持續性有機污染物甚至已污染到了兩極地區.2）農藥噴施時，部分農藥粗顆粒、粉粒落入土壤中,大氣中的農藥顆粒也會沉降進入土壤中，這些農藥在土壤中的分解緩慢，而數量又在不斷增加，導致土壤物理化學性質的改變，進而直接影響作物的生長；3）土壤中農藥殘留量及衍生物含量增加，對土壤中有益的動物及微生物具有明顯的危害，降低了土壤的生物活性，破壞了土壤的生態環境；4）土壤中的農藥被灌溉水、雨水沖刷到江河湖海中，污染水源，造成水生生物的大量死亡，同時也使漁業和養殖業遭受到經濟損失（邱小燕，2008）.

1.2 農藥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應

由于農藥的有效成分均具有一定毒副作用，在無尾兩棲類的棲息地水域受農藥污染后，必將導致在卵孵化及后期的發育和變態中出現不同程度的損傷，故表現出較高的死亡率和某些生理缺陷的發生.

1.2.1 對蝌蚪的活動行為和存活率的影響

在對有機磷農藥（二嗪磷）染毒的卞氏皺蛙（Ptychadena bibroni）蝌蚪的觀察中發現，隨著農藥濃度的升高，蝌蚪表現出逐漸強烈的回避反應，即呈現不正常的游泳姿態，軀體作劇烈的扭動；隨著染毒時間的延長，蝌蚪對觸動的反應逐漸遲鈍.暴露于梯度濃度的二嗪磷溶液中兩周的蝌蚪，死亡率隨著濃度的升高而升高，在25μg·L-1中蝌蚪的死亡率高達75%（Ezemonye and Ilechie,2007）；而與有機磷農藥有相近作用的有機氯農藥（DDT）對蝌蚪染毒情況的報道中，也指出其可以引起蝌蚪“多動癥”（Sparling et al.,2001）.對于這兩種農藥的作用機理，目前認為：農藥通過與蝌蚪乙酰膽堿酯酶的酯解部位結合，致使該酶失活，從而使乙酸膽堿積聚，引起膽堿能神經先興奮后抑制的一系列神經系統癥狀（黃伯俊，1993;Berrill et al.,1998;Broomhall,2005），神經系統的紊亂直接導致蝌蚪運動異常的發生，以及蝌蚪最后的死亡.

1.2.2 對胚胎發育和胚后發育的影響

在無尾兩棲類個體發育過程中，農藥對其有顯著影響.首先，農藥對蝌蚪有致死效應，但是致死率會受發育期的影響.通常孵化期、開口期對農藥刺激的敏感性較強，而孵化期之前、開口期之前及開口期之后的敏感程度均小于這兩個特殊時期，而在上述三者之間，孵化期的死亡率最低（盧祥云等，2002）.此種情況與不同發育時期的特點有關，孵化期胚胎脫離了卵膠膜的保護作用，致使農藥成分可直接滲透進入正在發育中的胚胎，故死亡率明顯提升；而到開口期后，蝌蚪開始了主動吞咽動作，農藥溶液隨水流進入蝌蚪消化道，又一次導致了死亡率的攀升.而經過了孵化期與開口期的“選擇”存活下來的蝌蚪，可通過自身的應激修復表現出一定的適應性（Pilar Honrubia et al.,1993），這種能力存在著明顯的個體差異.其次，農藥對蝌蚪具有顯著的致畸效應.如部分農藥可引起蝌蚪代謝受阻導致其體內的滲透壓改變，引起胚體水腫，表現在：蝌蚪尾部和軀體出現明顯扭曲，腹部膨大呈透明狀，四肢發育不健全（Bridges,2000）；由于蝌蚪體壁結構簡單，而其神經系統及脊索（柱）又位于體背部的表層，故極易受到農藥成分的浸蝕，進而引起神經系統及脊索（柱）發育的異常，導致蝌蚪出現扭曲（Bridges,2000;楊曉梅等，2001）.最后，農藥對蝌蚪的體重、體長也有顯著影響.如黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）蝌蚪在較高濃度的除草劑稻草隆溶液里，反應敏感，攝食活動相對頻繁，在蝌蚪的體重、體長的數值上遠遠超過對照組（劉木養等，2006）；而斑腿泛樹蛙（Polypedates leucomystax）蝌蚪在較高濃度的農藥溶液中卻表現出明顯的生長抑制現象（姚丹，2005;呂秀芬，1989），這種毒性效應的差異可能是由農藥種類及其毒性機制不同以及物種差異所致.

1.2.3 對組織結構的影響

鰓是蝌蚪與外界進行氣體交換的器官，由于鰓絲及其內毛細血管的結構相當簡單，故其對水環境中毒物具有極強的敏感性.農藥可導致蝌蚪鰓結構損傷.如在對伊比利亞綠蛙（Rana perezi）蝌蚪的觀察中，發現氨基甲酸酯類殺蟲劑（ZZ-Aphox）染毒第1天的蝌蚪鰓上皮細胞部分萎縮退化呈不連續狀態，但由于刺激了蝌蚪自身的應激機制，使上皮細胞粘液分泌增多，故經一段時間后結構呈恢復趨勢（Pilar Honrubia et al.,1993）.

肝臟是蝌蚪重要的解毒器官，在農藥作用下，蝌蚪肝臟結構與功能受損.主要表現在：肝臟外觀顏色變淺、肝細胞排列緊密、肝血竇增大、可見局部區域出現壞死現象、脂滴及糖原堆積、線粒體數量減少等（Pilar Honrubia et al.,1993）.農藥在蝌蚪體內代謝過程及蝌蚪的應激過程中均會產生較多的活性氧自由基，其可引起細胞結構（主要的膜性結構）的損傷，同時也可激活肝臟內有關抗氧化酶及一些代謝酶的活性，引起肝細胞代謝的異常（Pilar Honrubia et al.,1993;姚丹，2005;劉陽，2006）.

農藥同樣可影響蝌蚪另一個與解毒排毒有關的器官——腎臟.如在經敵敵畏染毒暴露10天后，斑腿泛樹蛙（Polypedates leucomystax）蝌蚪腎臟明顯萎縮，體積顯著縮?。╬＜0.01）（姚丹，2005），蝌蚪腎臟受損進而造成代謝廢物排泄障礙，死亡率上升.

除此之外，水環境中的農藥可通過蝌蚪皮膚的滲透，作用于分化中的生殖原基，導致蝌蚪性腺發育缺陷，嚴重影響兩棲類個體的正常繁殖功能，同時也導致畸形個體的增長，這是導致兩棲動物物種衰退的重要原因（Daughton and Tenres,1999;Hayes et al.,2003;Reeder et al.,1998;Sower et al.,2000）.

1.2.4 對抗氧化系統的影響

生物體在長期進化過程中，形成了一套完整的抗氧化系統，用于清除體內多余的活性氧.抗氧化酶作為抗氧化系統的重要組成，在診斷環境污染問題中發揮著重要的生物指示作用.動物體內的抗氧化酶主要包括：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽過氧化物（GSH-PX）和谷胱甘肽（GSH）等.當生物體遭受氧化脅迫時，其抗氧化酶就會被誘導或抑制（劉碩和周啟星，2008）.

以不同濃度的阿特拉津、敵百蟲、敵敵畏等溶液對無尾兩棲類蝌蚪進行染毒，其抗氧化系統變化均表現出相似規律：在較低濃度時抗氧化酶（SOD和CAT）作用不明顯，或具有一定的誘導作用，而在高濃度時卻表現出極顯著的抑制作用（謝文平和馬廣智，2003;楊麗華等，2003;苑宇哲等，2004;侯亞妮，2007;耿保榮等，2006）.這種雙向作用的機理可能是當蝌蚪機體中活性氧產生初期，誘導了機體應激反應，抗氧化酶活性升高；而當氧自由基大量產生并累積后，會導致抗氧化酶系的酶變性，從而降低了其活性，也有可能是通過使SOD合成酶失活或是酶的轉錄或翻譯途徑受阻所致，具體的作用機制有待于進一步探討.

1.2.5 對遺傳物質的影響

農藥對無尾兩棲類蝌蚪的遺傳毒性已被大量實驗證實.由于蝌蚪的紅細胞較大且易于觀察，因此蝌蚪紅細胞微核被廣泛用于水環境中農藥遺傳毒性的檢測，并獲得了較好的效果（Békaert et al.,1999;Hooftman and De Raat,1982;Grinfeld et al.,1986;Jaylet et al.,1986;湯新慧，1999;南旭陽，2000;周雪瑞等，2005;苑宇哲等，2005）.研究表明：農藥會誘導蝌蚪紅細胞微核及核異常產生，使微核率及核異常率顯著升高（封少龍等，2004）.Feng等（2004）采用微核試驗及彗星試驗研究了兩種新型殺蟲劑（Imidaeloprid和RH-5849）對黑斑蛙（Rana nigronaculata）蝌蚪及成體血細胞的遺傳毒性，發現當Imidaeloprid和RH-5849的濃度分別為8mg·L-1和40mg·L-1時，蝌蚪血細胞微核率比對照組有顯著提高；而濃度分別為0.05mg·L-1和5mg·L-1時，對黑斑蛙成體紅細胞DNA就有極顯著的損傷作用，且具有明顯的劑量-效應關系.鐘碧瑾等（2009）采用微核試驗和單細胞凝膠電泳技術研究發現三唑磷暴露下沼水蛙（Hylarana guentheri）蝌蚪微核率和核異常率顯著升高.蝌蚪細胞微核率的高低與農藥劑量、處理時間、細胞有絲分裂的速度等因素有關（王蕊芳等，1996;苑宇哲等，2005;樓允東和吳萍，1996;孟順龍等，1996）.

2 化肥污染及其對蝌蚪的毒性效應

2.1 化肥污染源

化肥是農業生產最基礎且最重要的物質投入，主要包括單元素化肥如氮肥、磷肥、鉀肥和由兩種至三種元素混合組成的復合肥.據聯合國糧農組織（FAO）統計，化肥在對農作物增產的總份額中約占40%～60%.盡管化肥在農業發展中有著不可替代的作用，但由于其使用量逐年增加，使土壤無機化現象愈加嚴重.據報導農作物對氮肥的綜合利用率僅為20%～30%，其余部分則滲透到淺層地下水，或隨雨水、灌溉用水流入地表水體中溶解形成N，不斷的累積導致水體氮素含量過高，引起水體的富營養化.而N在生物體內被還原成N，其可將血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白，從而使血紅蛋白的載氧能力下降，誘發高鐵血紅蛋白血癥，嚴重時使生物窒息死亡；同時水體的富營養促進了藻類的大量繁殖，致使水中的溶氧量降低，引起水質惡化進而也會威脅到其他水生生物的正常生存（苗德志和李松梧，2007）.近年來兩棲類動物數量的大量衰退可能也與此原因有關（Watt and Jarvis,1997;Rouse et al.,1999）.各種化肥中，氮肥用量最大，且對水體的污染最為嚴重，因此目前有關化肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應研究主要以氮肥為主.

2.2 氮肥對無尾兩棲類蝌蚪的毒性效應

2.2.1 對活動行為的影響

硝酸鹽類化肥對蝌蚪的毒性效應首先表現在行為異常方面（Baker and Waights,1993）.歐洲蟾蜍（Bufo bufo）蝌蚪接觸硝酸銨化肥溶液初期表現出無方向性的劇烈游動，且身體扭曲，但放回清水活動異常的現象逐漸減輕甚至消失；染毒6天后，蝌蚪出現勾尾、打圈游動；隨著濃度升高或時間延長，出現攝食率降低、游動無力且不平衡、碰觸反應遲鈍、體表黏液增多，最后蝌蚪活力明顯降低直至癱瘓而死.本實驗室對磷酸二銨染毒花背蟾蜍（Bufo raddei.）的觀察也證明了這一點，同時發現剛開始染毒的蝌蚪還有明顯的排便量增加的現象.造成這些現象的原因可能是多方面的，蝌蚪在主動吞咽作用時氮肥溶液進入其消化道，影響了腸道中的有益共生菌群，導致其消化功能異常，而表現出攝食頻率的降低（Hecnar,1995）；此外，氮肥可能通過滲透作用造成神經系統的損傷，進而引起了蝌蚪運動方式的異常，并改變了蝌蚪對環境的敏感性（Xu and Oldham,1997）；而蝌蚪體內的NO2-引起的血紅蛋白攜氧能力快速降低，最終影響蝌蚪的各種生理功能，導致其死亡（Train,1979）.

2.2.2 對存活率的影響

氮肥對蝌蚪的致死效應較為復雜.首先，不同物種蝌蚪對化肥的敏感程度不同（Geiffis-Kyle and Ritchie,2007;Hecnar,1995;XuandOldham,1997）.其次，不同化肥對同種蝌蚪的致死濃度也存在明顯差異，如碳酸氫銨對黑斑蛙（Rana nigronaculata）的致死濃度幾乎是尿素的48倍（丁道韌等，1992）.最后，氮肥的致死效應受蝌蚪發育期的顯著影響，如用同濃度的硝酸銨化肥溶液處理鋤足蟾（Pelobates cultripes）蝌蚪4天，新孵化的個體幾乎全部死亡，而發育期較晚的蝌蚪死亡率則不到40%（Ortiz-Santaliestra et al.,2006），此現象說明蝌蚪不同發育期可能對化肥的敏感程度存在顯著差異.現有實驗結果均提示由于蝌蚪在不同發育時期具有不同的形態結構、生理功能，導致其對外界環境因素刺激的反應不同，在農業生產中對化肥的使用，應結合蝌蚪的發育時間合理安排，調整使用濃度、使用時間或種類，從而在保證農作物對肥料需求基礎上，盡可能地避開在蝌蚪發育的“脆弱”階段使用對蝌蚪傷害大、或者超出蝌蚪最大耐受濃度的使用量.

2.2.3 對生長發育和免疫系統的影響

氮肥可引起蝌蚪發育畸形（Marco and Blaustein,1999）.以硝酸鹽類化肥為例，當濃度在100mg·L-1時即可導致歐洲蟾蜍（Bufo bufo）蝌蚪17%的畸形率，并呈現出隨濃度升高，畸形率升高的趨勢（Xu and Oldham,1997）.畸形的類型有：蝌蚪頭、胸部發育不對稱、眼睛畸形、腹部水腫透明、尾部有水腫的瘤泡出現及勾尾等現象（Hecnar,1995）.蝌蚪正常情況下，可以維持自身的滲透壓，但在化肥溶液中浸浴后，由于化肥的離子作用，破壞了蝌蚪正常的調節功能，失去了維護體內正常滲透壓能力.而由于化肥對蝌蚪的損傷作用是一個由表及里的過程，因此，隨著染毒時間的延長，化肥對蝌蚪的作用勢必會深入至蝌蚪生理功能的調節方面，既影響到各種分泌腺的功能，甚至殃及蝌蚪的免疫調節方面.

以化肥的降解副產物——高氯酸鹽處理南方豹蛙（Rana sphenocephala）蝌蚪，用硝酸鉀化肥浸染美洲林蛙（Rana sylvatica）蝌蚪均發現其變態發育時間延長，甚至有很大比例不能完成變態發育過程而死亡（Ortiz-Santaliestra and Sparling,2007;Greulich and Pflugmacher,2003;Geiffis-Kyle,2005）.組織學觀察發現蝌蚪的甲狀腺腺泡體積明顯縮小，進而表現出對甲狀腺激素分泌的抑制（Ortiz-SantaliestraandSparling,2007;Greulichand Pflugmacher,2003;Geiffis-Kyle,2005）.有實驗指出硝酸鹽化肥染毒3周后，蝌蚪體內白細胞的數量和血紅蛋白的含量均明顯降低，即蝌蚪的免疫系統在化肥的作用下，也表現出了一定程度的損傷（Rouse et al.,1999;Dappen,1983）.

2.2.4 對組織結構及遺傳物質的影響

有關化肥對蝌蚪組織結構和遺傳物質的影響尚鮮有報道.本實驗室初步觀察發現，氮肥磷酸二銨可對花背蟾蜍（Bufo raddei.）肝臟組織造成明顯的損傷，其顯微及超微結構變化表現在：肝細胞呈明顯的脂肪變性，出現由于淋巴細胞浸潤形成的斑塊狀壞死區域，核內異染色質濃縮，粗面內質網擴張，部分細胞內出現髓樣結構，且血竇內的淋巴細胞、巨噬細胞和枯否細胞逐漸增多；肝細胞糖原含量隨磷酸二銨作用時間延長而降低，隨化肥濃度升高而增多；蛋白含量和乳酸脫氫酶活性隨染毒濃度升高和時間延長有增加的趨勢；肝細胞內不同類型的抗氧化酶活性雖然變化有所不同，但酶活性變化均有明顯的劑量-效應和時間-效應.此外，還發現磷酸二銨對蝌蚪也具有遺傳毒性，可誘導蝌蚪紅細胞微核及核異常的產生，并且紅細胞微核率、核異常率與濃度、染毒時間呈現明顯的相關性；從實驗結果看，低于大田施肥量的磷酸二銨，已經構成了對蝌蚪組織結構和遺傳物質的毒性效應（王銳等，2009）.

3 結語

近幾十年來，全球范圍內的兩棲類動物出現了較快的種群數量下降，其中一些物種已經滅絕.由于兩棲類個體發育的特殊性，其對生境的島嶼化、水質的污染、疾病、人為過度捕捉等多種因素表現出高度的敏感性（于鳳蘭和陸宇燕，2006）.農藥與化肥的不合理使用所引起的水體污染是造成這一現象的重要原因.

農藥可對無尾兩棲類蝌蚪的影響目前研究較為深入，其對蝌蚪活動行為、胚后發育、組織結構、抗氧化系統、遺傳物質等造成的損傷已有充分的實驗依據，但是還有一些問題值得進一步探討：1）蝌蚪通過體內哪些途徑對農藥的毒性產生抗性或適應性，從而在低毒農藥染毒下死亡率維持在較低水平？2）關于農藥對蝌蚪組織器官的損傷研究較少，其中各器官組織產生功能損害的機制是否與細胞凋亡有關？3）農藥的神經毒性是否只與抑制乙酰膽堿酯酶活性有關？對于神經沖動的傳入和傳出過程是否也會有影響？4）農藥對蝌蚪生殖系統發育的影響有哪些具體途徑參與，目前國內外缺乏此部分研究.5）農藥對蝌蚪內分泌和免疫系統的毒性研究相對不足.

與農藥相比，國內外關于化肥對無尾兩棲類蝌蚪影響的研究相對較少，對化肥對蝌蚪的毒性研究主要集中在存活率、孵化率及畸形率變化等宏觀方面，對微觀方面的研究相對貧乏.建議進一步的研究可從如下幾方面進行：1）從分子（基因、蛋白）、細胞、器官和整體水平上，綜合探討化肥對蝌蚪產生損害的機制與規律.2）化肥污染是否會引起蝌蚪個體生殖系統的損傷，進而影響其正常的繁殖，最終導致種群的衰減，還有待于證實.3）確定蝌蚪體內對化肥污染較敏感的生物指標，將會為化肥污染的監測提供極大的幫助.4）關于化肥對蝌蚪遺傳物質的影響尚需進一步研究.

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Research Advances in Toxicological Effects of Pesticide and Fertilizer Pollutants on the Anuran Larvae

LI Zhen1，LI Pi-peng1，XU Qi-yan2，LU Yu-yan1，*

1.Center for China Herp-Breeding and Conservation Research,Key Laboratory of Evolution and Biodiversity in Liaoning,Shenyang Normal University,Shenyang 110034
2.Liaoning Cancer Hospital&Institute,Shenyang 110042

The amphibian is considered as a suitable animal model to determine the toxicity of polluted environmental and to monitor the environmental health.The embryonic development and metamorphosis of amphibians are highly dependent on the water,and the gill and skin are highly permeable.When exposed to pollutants,amphibians can be changed obviously on the level of the molecule expression,cellular and tissue structure,and physiology.The pollutants may affect the survival and growth of amphibians.In this paper,it was summarized and reviewed that the toxic effect of pesticides and fertilizers on the behavior,growth and development,structural,physiological and biochemical changes of amphibian larvae,in order to provide a comprehensive scientific basis for monitoring the environment of water and logical rational use of agricultural compounds.

tadpole；fertilizer；pesticides；environmental monitoring

12 October 2009accepted1 December 2009

1673-5897（2010）2-287-08

X171.5

A

2009-10-12錄用日期：2009-12-01

國家自然科學基金項目（No.30470206；No.30870276）；遼寧省優秀人才支持計劃和省高?？蒲杏媱濏椖?/p>

李貞（1984—），女，碩士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:luyuyan2001@yahoo.com

陸宇燕（1962─），女，教授，研究方向：細胞生物學；兩棲爬行動物生物學及其保護與繁育.