遠志對 A β 25-35誘導 AD模型大鼠海馬區 NF-κ B活化研究

黃作義,許志剛,吳成吉,張曉梅,朱曉峰

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是發生于老年和老年前期,以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性病變,是老年期癡呆的最常見類型,約占老年期癡呆的50%。臨床上表現為記憶障礙、失語、失用、失認、視空間能力損害、抽象思維和計算能力損害、人格和行為的改變等。截止 2006年,全球癡呆患者約有 2430萬(我國 500萬 ),每年新發病例460萬(我國 30萬),且每年翻一番。各國調查趨勢匯總顯示,癡呆患病率在 2%～ 7%,女性多于男性[1]。N F-κB是一種廣泛存在于真核細胞內可將信息從胞漿傳至細胞核并引起相應基因表達的重要轉錄因子,活化后可調控眾多細胞因子和炎癥介質的基因表達,調節免疫反應,參與細胞內信號傳遞。遠志是著名的益智藥物,遠志藥草的命名就集中地體現了益智強記的主要功能,始載《神農本草經》,至今,中醫臨床實踐已近兩千年。本實驗以海馬區注射 A β25-35建立的 AD模型大鼠為研究對象,從 NF-κB活化角度探討遠志對 AD的防治作用。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級 Wistar大鼠 96只 ,雄性 ,體重 250～ 300g,由佳木斯大學醫學實驗動物中心提供,標準鼠飼料飼養。

1.2 實驗藥物

遠志:由哈爾濱三九藥業生產,1g相當于6g飲片。

1.3 主要試劑

A β 25-35(武漢博士德生物工程有限公司),NF-κBp65激活-核轉運試劑盒 (碧云天生物技術研究所),兔抗大鼠 P-I κ B α抗體 (上海迪奧生物技術有限公司),兔抗大鼠 IκB α、SABC免疫組化檢測試劑盒、DAB染色試劑盒 (武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要儀器

單臂腦立體定位儀(M P8000)(深圳瑞沃德生命科技有限公司);Morris水迷宮 (成都泰盟科技有限公司);熒光倒置顯微鏡(IBE2000)(重慶光電儀器有限公司)。

2 方法及檢測指標

2.1 動物分組

將96只大鼠隨機分為正常對照組,假手術組,模型組 ,遠志低、中、高劑量組共6組,每組16只。

2.2 AD動物模型制備

將 A β 25-35肽段 lmg溶于0.5mL滅菌生理水中,濃度為 2 μg/μL,37℃恒溫孵育一周,使其變為聚集態的 A β,放置于4℃冰箱備用。模型組,遠志低、中、高劑量組以10%水合氯醛 (0.35mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠;麻醉成功后,立體定位儀固定頭部,顱頂區備皮,常規消毒手術區皮膚。沿顱頂中線作 2cm切口,分離骨膜使頭骨暴露,參照《大鼠腦立體定位圖譜》,海馬區定位坐標:于前囟向后3.0mm,中線左右各旁開2.0mm,用牙科鉆鉆開顱骨 ,垂直進微量進樣器針2.8mm,將5μL溶液緩慢注入,留針5min,以保證溶液充分彌散,然后緩慢撤針,縫合切口皮膚,青霉素肌注8萬單位 /次,連續肌注3d,假手術組手術方法相同,注射同體積的生理鹽水。

2.3 給藥方法

用開水按比例稀釋成0.083g/mL,0.167g/mL,0.334g/mL低中高三個劑量組,4℃保存。各組大鼠均按1mL/100g·d。A β注射后第 7天開始灌胃給藥 ,連續 4周。

2.4 各組大鼠海馬區 NF-κB p65的活化

制作腦冠狀石蠟切片,用免疫熒光法測定海馬區 N F-κB p65核移位情況,所有操作嚴格按照碧云天生物技術研究所 N F-κ B激活-核轉運試劑盒說明書進行。

2.5 各組大鼠海馬區 P- IκB α、 I κ B α的表達

免疫組化步驟(SABC法),按試劑盒說明書操作步驟進行。

2.6 統計學分析

采用 SPSS13.0軟件對數據進行單因素方差分析,以P＜0.05為顯著性差異水平。統計陽性細胞數的計算取每只大鼠腦組織切片3張,每張切片于海馬區隨機選取5個區域,在400×顯微鏡下計算此區域內的免疫組化染色為陽性細胞數,將所得均數作為每只動物的陽性細胞數作為統計資料,結果以 (±s)表示。

3 結果

3.1 海馬區 NF-κB p65的活化

N F-κ B p65呈紅色熒光,細胞核呈藍色熒光 ,如細胞核內出現粉色熒光則表示 N F-κ B進入核內為陽性細胞。與正常對照組相比,假手術組中 N F-κ B蛋白陽性細胞數無顯著差異。與正常對照組和假手術組比較,其余各組 N F-κB蛋白陽性細胞數均顯著增加 (P＜0.05)。與模型組比較 ,遠志各劑量組中 NF-κB蛋白陽性細胞數均顯著減少(P ＜0.05)。與遠志低劑量組比較 ,遠志中、高劑量組中 NF-κB蛋白陽性細胞數均顯著減少 (P＜0.05)。與遠志中劑量組比較,遠志高劑量組中 N F-κ B蛋白陽性細胞數無顯著差異。

3.2 海馬區 P- IκB的表達

P-I κ B陽性細胞定位于細胞漿,呈棕黃色。與正常對照組和假手術組相比,模型組、遠志低中劑量組 P-I κ B蛋白陽性細胞數均顯著增加 (P＜0.05),遠志高劑量組中 P- IκB蛋白陽性細胞數無顯著差異。與模型組相比,遠志低中高劑量組 P-I κ B蛋白陽性細胞數均顯著降低 (P ＜0.05)。

3.3 海馬區 I κ B的表達

Iκ B陽性細胞定位于細胞漿,呈棕黃色。與正常對照組和假手術組相比,其余各組 Iκ B蛋白陽性細胞數均顯著降低(P ＜0.05)。與模型組相比,遠志低、中、高劑量組, Iκ B蛋白陽性細胞數逐漸增加,遠志高劑量組 Iκ B蛋白陽性細胞數顯著增加 (P＜0.05),但仍低于正常對照組和假手術組(P ＜ 0.05)。

表1 各組對大鼠海馬區 NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB陽性細胞數 [±s,例數(個)]

表1 各組對大鼠海馬區 NF- κ B p65、P- Iκ B、 IκB陽性細胞數 [±s,例數(個)]

注:與正常對照組和假手術組相比*P＜0.05;與模型組相比#-P ＜0.05。

組別 N F- κ B p65 P- Iκ B α Iκ B正常對照組 7.88± 2.42 17.88±5.00 35.13±5.67假手術組 8.25± 1.91 19.75± 5.01 33.75±6.04模型組 41.38± 5.13* 51.75± 6.99* 13.88±3.23*遠志低劑量組 32.63±4.96*# 38.00±4.44*# 15.25±2.71*遠志中劑量組 19.88±4.40*# 25.13±5.36*# 17.38±3.11*遠志高劑量組 22.13±4.46*# 24.50±3.74# 21.25±3.88*#

4 討論

現代醫學對阿爾茨海默病的病因和發病機制尚不明確,目前主要有β淀粉樣蛋白級聯學說、Tau蛋白學說、遺傳因素學說、慢性炎癥學說、氧化應激學說等。AD除了具有大腦皮質萎縮、神經元缺失、神經纖維纏結、老年斑等病理特征以外,還伴隨著一個緩慢的炎癥病理改變過程[2]。Bales等也研究發現,用 A β作用于原代培養的星形膠質細胞后,能以時間一劑量依賴型的方式激活 N F-κB,并通過激活的 N F-κ B上調 IL- lβ和 IL-6的表達。在 AD病人腦組織切片的免疫組化分析中發現 NF-κ Bp65處于活化形式并且在神經元及星型膠質細胞中處于激活狀態,這些 NF-κB激活的細胞僅局限于老年斑的附近[3]。NF-κ B是一種廣泛存在于真核細胞內可將信息從胞漿傳至細胞核并引起相應基因表達的重要轉錄因子。沒有外界刺激時,N F-κB在胞質中與其 NF-κB抑制蛋白( IκB)結合,呈不具活性的狀態。許多刺激因子均可使 NF-κB活化,在這些因子的作用下,I κ B激酶(IKK)激活,使 I κ B磷酸化,泛素化,降解,從而使 NF-κB活化。NF-κB活化后其 p65亞基上的 NLS暴露,使活化的 NF-κB轉移入胞核,并與 DN A的 κ B反應元件結合,從而調節特異基因的轉錄表達。而由于 I κ B a啟動子含有 κ B結合的位點, IκB a的轉錄受到 NF κB的調節,活化的 N F κ B能夠上調 IκBa mNRA水平 ,新合成的 IκBa進入核內與 NF κ B結合 ,使其從DN A上解離下來 (NF κ B與 IκB蛋白的親和力高于其與DN A的親和力), IκBa分子中的核輸出序列 N ES(nuclear export signal)再促使 N F κB重新回到細胞質中[4]。遠志是自古以來的益智良藥,因此國內學者用各種 AD模型從行為學研究、抗氧化、清除自由基、抗炎的作用,對神經細胞的護作用及對中樞膽堿能系統的影響等方面對遠志的益智作用進行了相關研究。

通過實驗研究表明,遠志能夠抑制 AD模型大鼠海馬區N F κB活化,這種作用主要是通過抑制 IκB a降解而不是通過刺激 IκBa蛋白合成增加來實現的。遠志減輕 IκB a磷酸化的機理還需進一步探討。

[1]賈建平.神經病學 [M].第6版.北京:人民衛生出版社,2008,214-219

[2]Fiala M,Zhang I,Can X.Amyloid-beta induces chemokine secretion and monocyte migration across a human blood-brain barrer mode[J].Mol Med,1998,4(7):480-489

[3]Bales KR,Du Y,Dodel RC,et al.The NF-kB/Rel family of protei-ns mediates A-beta-induced neurotoxicity and glial activation[J].Brain Res Mol Brain.Res,1998,57(1):63-72

[4]Tak PP,Firestein GS.NF-kappa B:a key role in inflammatory diseases[J].J Clin Invest,2001,107(l):7-11