航天搭載紫花苜蓿連續后代變異株系選育

范潤鈞，鄧 波，陳本建，柴小琴，張蘊薇

（1.甘肅農業大學草業學院，甘肅蘭州730070；2.中國農業大學動物科技學院，北京100193；

3.甘肅省天水市農業科學研究所，甘肅天水741000）

航天育種（或太空育種）又稱空間誘變育種，其具有變異頻率高、變異幅度大、有益變異多、穩定性強，優勢明顯。它是指利用返回式衛星或高空氣球將植物種子帶到太空，利用太空特殊的環境（空間宇宙射線、微重力、高真空、弱磁場等因素）使種子產生變化，引起生物體染色體畸變，進而導致生物體遺傳變異，經地面種植選育新種質、新材料，培育新品種的植物育種新技術[1]。航天育種研究開始于1987年，到目前為止，我國利用返回式衛星先后進行了13次70多種農作物的空間搭載試驗，共搭載糧食、經濟作物、蔬菜、花卉、微生物菌株等800多個品種，經全國23個省市109個科研及生產單位的農業專家和技術人員的試驗選育，取得可喜的成果[2]?？臻g誘變作為一種新的物理誘變手段，已被廣泛應用于多種生物材料誘導變異，從中選育出一批新的優良品種，顯示了空間環境中致突變因素的存在及其有效性[3]。

本研究是在篩選出航天搭載紫花苜蓿第1代突變單株的基礎上，為后續世代的高品質選育工作進行展望，并提出建議和方法。

1 空間搭載紫花苜蓿種子第1代植株表型變異及基因多態性分析

1.1 供試材料

為4個紫花苜蓿品種，搭載于“神州三號”衛星，飛行時間從2002年3月25日至4月1日，共7 d，飛行高度為198～338 km，傾角42.4°，繞地球108圈[4]。4個紫花苜蓿品種分別為：A.得福（52株）；B.德寶（47株）；C.阿爾剛金（66株）；D.三得利（59株），均為SP1植株。于2009年4月22日取自甘肅天水西部航天育種中心。

1.2 主要技術路線

田間性狀調查選材→DNA的提取→SSR引物的篩選→SSR-PCR擴增→瓊脂糖凝膠電泳→聚丙烯酰胺凝膠電泳→電泳譜帶的統計分析→數據處理→確定變異單株。

1.3 試驗結果

經搭載后的種子萌發獲得的第1代（SP1，表示經飛船搭載后回收種植的第1代，后面各世代依次類推）植株中，大部分生長正常，無嚴重生理損傷，且結實率接近地面對照。但也有一些植株高度、葉片大小及葉色等發生了變化。根據4個主要變異性狀植株較高、葉色較深、葉片較大、多葉，分別篩選出4個紫花苜蓿品種的變異單株。

采用正交設計優化紫花苜蓿SSR-PCR反應體系，25μL反應體系包括 Mg2+2.5 mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，引物 0.7μmol/L，Taq DNA聚合酶2 U以及2.5μL 10×buffer和60 ng模板DNA。循環參數為：94℃預變性3min；95℃變性1min，52 ℃退火 1.5min，72 ℃延伸 60 s，共循環35次；最后72℃保溫8min；4℃保存。利用該反應體系從17對SSR引物中，篩選出6對擴增產物具有穩定多態性的引物。

利用優化的SSR-PCR反應體系及篩選出的多態性較好的引物，對材料進行檢測，共檢測到25個等位基因，每對引物檢測出2～8個等位基因，平均為4.17個。結合4個突變指標，檢測經過篩選的植株的等位基因頻率及每個位點的多態性信息量（PIC），PIC變化于0.221 6～0.832 8之間，平均為0.636 6，并對多態基因植株與篩選出的表型變異植株的多態性作相關性分析，根據檢測結果初步確定13株突變植株（表1）。

由表1可 知，A-07，B-35，C-01，C-28 和D-21這5個SP1植株，可在其基因組檢測到7個以上的多態性等位基因。結合表型變化分析發現，基因組多態率高的植株大多數都有較明顯的變異表型（如 C-01，C-28，D-49等）；但也有個別基因組多態率高的植株（如A-07），在本研究觀察的數個表型范圍內未發現形態性狀的變異?？梢?，SP1植株的基因組DNA多態性與所觀察的表型變異之間有一定的相關性，但不是必然聯系。

表1 基因組多態率較高的SP1植株及其表型變異

2 篩選株系后代植株表型及基因組變異展望

2.1 后續世代的種植和篩選方法

林作楫等[5]在1996年選用不同小麥品種（品系）進行衛星搭載，搭載種子在田間種植后，對SP2進行分析，可看到部分搭載材料在一些重要農藝性狀上有明顯變異，從中選出一批優良品系，產量較原始品種（品系）有顯著提高，預期將有2～3個材料在生產上推廣。本試驗通過表型觀察以及分子標記手段，從SP1植株中共篩選出13個株系，每個單株收種30粒，種植成SP2株系，再用同樣的種植篩選方法，經3～4代（SP3～SP4）選育獲得形態性狀明顯變異并能穩定遺傳的突變株，種成SP5的突變株系。另外，還混收與地面對照組形態性狀沒有明顯差異的第1代單株種子，混播種植SP2，繼續選擇與地面對照組形態性狀有明顯差異的單株，對形態性狀變異的單株進行多代種植和選育，獲得形態性狀明顯變異并能穩定遺傳的突變株系。具體種植及篩選流程如圖1所示。

2.2 篩選株系后代植株表型及基因組變異探討

與地面對照組相比，篩選出的13株SP1植株，大多數都存在表型變異特征。一般變異植株在其后的連續3代的分離有以下3種類型[6-8]：（1）前代的某些形態性狀變化在后代某些單株得以保留，甚至更明顯；（2）前代單株的形態性狀變化在后代中逐漸回復；（3）后代單株出現前代所沒有的新的形態性狀變化。

為探索經飛船搭載后種子的基因組變異在世代遺傳中的規律性，進一步應用分子標記技術跟蹤分析以上13個篩選出的變異單株及其連續多代單株基因組變化。

經過4代種植和跟蹤分析后，探求穩定突變株系基因組多態性等位基因的來源以及能否穩定地遺傳給后代，以選育出高品質紫花苜蓿。然后對穩定突變株的連續多代（即從第一代開始到穩定突變體的連續多代）作分子標記檢測，進而找到穩定遺傳的突變單株。

3 穩定突變體生理生化指標檢測

對穩定遺傳的突變單株進行生理生化指標檢測，進一步證明突變株系的優良變異。經過圖1的篩選模式，對每一代材料都綜合田間性狀觀察、考種分析數據，選出性狀變異較明顯的單株。對穩定突變株系的變異性狀進行多代跟蹤，并用Excel軟件的單因素顯著性分析方法，對突變株系與地面對照組的各性狀進行顯著性比較分析。同時，檢測變異單株各項生理生化指標[9]。（1）與抗旱性相關的生理指標：葉片相對含水量、細胞膜透性、葉綠素含量、POD活性、葉片超微結構。（2）與抗寒性相關的生理指標：SOD活性、POD活性、CAT活性、游離脯氨酸含量、葉綠素含量、抗壞血酸含量。（3）與耐鹽堿生理相關的指標：細胞膜透性、丙二醛和游離脯氨酸含量、株高、鮮質量、干質量。

4 世代遺傳討論

由于太空空間存在各種無法控制的誘變因素，因此，空間誘變處理對作物的誘變方向也具有不確定性。一方面空間誘變可以創造出符合人類需要的各種變異類型，經過選擇可以創造有益的新種質，培育新品種。另一方面，空間誘變群體中并不是所有的變異都是有利的，而且空間誘變也不是對所有性狀都能產生顯著的作用[10]。

一般認為，飛船搭載使被搭載的種子基因組產生損傷，第一代植株基因組中的變異可以遺傳給后代單株，使后代單株基因組與前代具有相同的多態性；遺傳物質DNA分子的輻射損傷也可能部分被修復，后代單株基因組多態率下降；而DNA分子的輻射損傷不完全修復或錯誤修復，也可使后代單株基因組出現新的多態性等位基因，多態率增加。經過4或5代的種植，未修復的損傷及其導致的基因組變異能穩定地遺傳給后代，獲得表型和基因型變異均穩定的突變株系[4]。

［1］ 密士軍，郝再彬.航天育種研究的新進展[J].黑龍江農業科學，2002（4）：31-33.

［2］ 蔣興村.農作物空間誘變育種進展及其前景[J].中國航天，1997（2）：5-8.

［3］ 丘運蘭，何康遠，梅曼彤，等.太空飛行對玉米種子的生物學效應[J].華南農業大學學報，1994，15（2）：100-105.

［4］ 駱藝.飛船搭載水稻種子連續世代遺傳變異及基因組多態性分析[D].廣州：華南農業大學，2006.

［5］ 林作楫，雷振生，揭聲慧，等.小麥搭載衛星進行誘變育種研究初報[J].華北農學報，2000，15（4）：7-9.

［6］ 李社榮，曾孟潛，劉雅楠，等.植物空間誘變研究進展[J].核農學報，1998，12（6）：375-379.

［7］ 周峰，易繼財，張群宇，等.水稻空間誘變后代的微衛星多態性分析[J].華南農業大學學報，2001（22）：55-57.

［8］ 易繼財，王慧.空間搭載誘導水稻種子突變的分子標記多態性分析[J].生物物理學報，2002，18（4）：478-483.

［9］ 武曉軍.航天誘變棉花生物學效應及突變體多態性分析[D].武漢：華中農業大學，2006.

［10］ 田伯紅，孔德平，王建廣，等.航天誘變對農作物的生物學效應及育種成就[J].山西農業科學，2008，36（4）：14-16.