短發卡狀RNA抑制人Bub1基因表達及其對人卵巢癌A2780細胞藥物敏感性和周期的影響

周婷 翁丹卉 王世宣 盧運萍 馬丁

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科，湖北 武漢 430030

短發卡狀RNA抑制人Bub1基因表達及其對人卵巢癌A2780細胞藥物敏感性和周期的影響

周婷 翁丹卉 王世宣 盧運萍 馬丁

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院婦產科，湖北 武漢 430030

背景與目的：既往研究提示，紫杉醇類藥物作用的發揮有賴于功能完整的紡錘體檢查點，而Bub1是紡錘體檢查點的重要組成部分。本研究旨在探討Bub1短發卡狀RNA真核表達載體穩定轉染對人卵巢癌A2780細胞紫杉醇敏感性及細胞周期的影響。方法：構建Bub1基因短發卡狀RNA真核表達載體pEGFP-Bub1-shRNA，以脂質體LipofectamineTM2000包裹空質粒轉染體外培養的人卵巢癌細胞株A2780后進行穩定篩選。應用RT-PCR、Western印跡法分析目的基因mRNA及其蛋白水平的表達情況；MTT法、流式細胞術等方法檢測轉染前后，A2780細胞對紫杉醇敏感性及其細胞周期的變化；Hoechst33342染色法檢測細胞分裂指數。結果：與對照組pEGFP-C1/A2780及A2780組相比，pEGFP-Bub1-ShRNA/A2780組細胞中mRNA和蛋白水平的表達均明顯下降，其差異具有統計學意義（P＜0.05）；MTT檢測結果提示，轉染pEGFP-Bub1-shRNA質粒后細胞對紫杉醇的敏感性明顯降低，與對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）；流式細胞術檢測結果顯示，紫杉醇1 μmol/L處理細胞24及48 h后,與pEGFP-C1/A2780及A2780組相比，該組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），G2/M期細胞比例下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；Hoechst33342染色提示，與對照組相比，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組的分裂指數（MI）明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論：Bub1基因的下調可導致人卵巢癌A2780細胞對紫杉醇敏感性及G2/M期細胞比例下降。pEGFP-C1-shBub1質粒的成功構建，為研究Bub1基因的功能及定位的研究提供了進一步的實驗條件。

卵巢癌； Bub1基因； 紫杉醇； 耐藥

細胞在長期的進化過程中產生的監控紡錘體形態、染色體著絲點與微管的連接及其產生的張力，確保姐妹染色單體精確分離的質控機制，即為紡錘體檢查點［1］。紡錘體檢查點是細胞周期的最后關卡，是近年來細胞分子生物學的研究熱點。早在上世紀90年代初，研究人員就在酵母體內確定了6種執行紡錘體檢查點功能所必需的基因：Bub1、Bub2、Bub3、Mad1、Mad2及Mad3，而蛋白激酶Bub1是紡錘體檢查點的平臺蛋白。截至目前，有關紡錘體檢查點的功能尚存在較多爭議，而其精細調節機制更有待于深入探討。紫杉醇作為一線化療藥物在實體瘤包括乳腺癌及卵巢癌等惡性腫瘤的治療方面取得了巨大成功，但臨床上耐藥病例仍頻繁發生［2］。眾所周知，紫杉醇是一種微管穩定劑，通過抑制微管解聚進而阻滯細胞周期殺傷腫瘤，而有研究提示這種殺傷作用必須有賴于具有完整功能的紡錘體檢查點。雖然突變在實體瘤中并不常見，但紡錘體檢查點功能低下卻時有發生。Bub1是否直接影響紡錘體功能并進而導致腫瘤的化療耐藥，國內尚未見諸報道。siRNA在干擾基因表達的效率和時長均顯不足，而本研究通過穩定轉染pEGFPBub1-shRNA質粒，使干擾效率大為增強，且其具有更高的穩定性，為深入探討卵巢癌細胞紫杉醇化療耐藥機制的研究提供了有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑宿主菌大腸埃希菌DH5α由華中科技大學同濟醫院婦科腫瘤實驗室保存；質粒pEGFP-C1購自Invitrogen公司；限制性內切酶購自日本Takara公司；脂質體、G418和TRIzol購自Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）及紫杉醇購自德國Sigma公司；PCR引物由上海生物工程服務有限公司合成；抗人Bub1鼠單克隆抗體購自Chemicon公司；抗人betaactin鼠單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.2 人Bub1 shRNA真核表達載體的構建及鑒定對真核表達載體pEGFP-C1進行測序后分別用EcoRⅠ和MluⅠ雙酶切處理，瓊脂糖電泳后回收，純化酶切產物，隨后由PCR反應得到，含一個U6啟動子及上述2個酶切位點的Bub1-shRNA序列（核心序列1為5’-GAGTGATCACGATTTCTAA-3’，核心序列2為5’-CCAUGGGAUUGGAACCCUGTT-3’，核心序列3為5’-CCAGGCUGAACCCAGAGAGTT-3’）以T4連接酶連接3 h，轉化感受態DH5α。篩選可疑重組陽性菌株，以250 r/min（型號：Crystal, IS-RSD2）的轉速，37 ℃搖菌過夜，小提質粒后用BamHⅠ和HindⅢ雙酶鑒定，將獲得的人Bub1重組質粒命名為pEGFP-Bub1-shRNA，并依次編號后送Invitrogen測序。

1.3 細胞培養人卵巢上皮性癌細胞株A2780購自歐洲細胞培養物收藏中心（European Collection of Cell Cultures，ECACC），來源于未經治療的卵巢癌患者的癌變組織。用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液在37 ℃、CO2體積分數為5%、相對濕度90%的培養箱中培養，細胞呈貼壁生長。取對數生長期的A2780細胞接種于6孔板（細胞數為2×105個/孔）。待細胞密度為70%時，應用LipofectamineTM2000脂質體包裹pEGFP-C1空質粒和pEGFP-Bub1-shRNA 2種質粒，分別轉染A2780細胞，500 mg/L G418加壓篩選14 d左右得到陽性轉染細胞分別命名為pEGFP-C1/A2780和pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細胞。同時設未轉染任何質粒的A2780細胞作為空白對照。

1.4 RT-PCR檢測Bub1 mRNA的表達收集各組細胞，用TRIzol試劑一步法提取細胞總RNA，并用M-MLA反轉錄酶反轉錄獲得cDNA；PCR擴增以cDNA為模板，以GAPDH為內參照。Bub1引物序列（459 bp）上游引物：5’-TAAACCCACAGGAGCCAGGAC-3’，下游引物：5’-CAAGCCTCAACGCCCAACT-3’；擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s， 56.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，29個循環；72 ℃終延伸10 min。GAPDH引物（250 bp）：上游引物：5’-ACGGATTTGGTC-GTATTGGG-3’；下游引物：5’-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3’；擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s、54 ℃退火45 s、72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照，每個樣本至少重復3次。

1.5 Western印跡法檢測各組細胞Bub1蛋白水平的差異收集細胞，提取總蛋白，取40 μg蛋白行SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白質轉移至甲醇激活的PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃反應過夜，用含0.05% Tween20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，每次10 min；加入相應的堿磷酶標記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫條件下反應1 h，用顯色底物NBT/BCIP/AP buffer （1∶1∶250）顯色，以等量β-actin蛋白質作為對照，每個樣本至少重復3次。

1.6 MTT法測定各組細胞對紫杉醇的敏感性取經篩選、擴大培養后的各組細胞，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×103個/孔接種于96孔板，培養24 h后，加入不同濃度（30、90、300和1 000 nmol/L）的用相應培養液稀釋的紫杉醇溶液200 μL，每一濃度設3個復孔，并設不加藥物和不加細胞的對照組，繼續培養48 h，每孔加1 mg/mL MTT溶液100 μL作用4 h，棄上清液，最后每孔加入DMSO 150 μL，振蕩使其充分溶解，在96孔板酶標儀上測定波長為570 nm的吸光度值(A)，按下述公式計算細胞生長抑制率。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率收集經紫杉醇（1 μmol/L）作用24及48 h的各組細胞，將細胞先用冷PBS洗滌，75%乙醇于-20 ℃條件下固定過夜，洗滌細胞常規離心（1 500 r/min）15 min （Sigma，No.11030，r=15 cm），加入含有10 μg/mL PI和0.1%RNase A的PBS液500 μL，室溫避光染色30 min后上流式細胞儀測定細胞周期及凋亡率。

1.8 分裂指數（MI）的測定各組細胞接種于蓋玻片上，1 μmol/L紫杉醇處理24 h，10 μg/mL Hoechst33342染液（Sigma Chemical Co. Louis，MO）室溫染色細胞15 min后PBS洗滌，直接于熒光顯微鏡下觀察。計數3個以上細胞數≥100的視野，MI=分裂細胞數/總細胞數×100%。

1.9 統計處理應用SPSS13.0統計軟件對實驗數據進行統計學處理，實驗數據以表示，組間比較采用非參數檢驗和方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 重組質粒構建成功將合成退火片斷與線性載體連接、轉化后，挑選單克隆培養于LB培養液搖菌擴增，提取質粒DNA，BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定插入片段，確定6個克隆插入一段約360 bp的片斷（含1個約300 bp的U6啟動子），測序證實插入為所需片斷（圖1）。

圖 1 人真核表達質粒pEGFP-Bub1-shRNA的酶切鑒定Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pEGFPBub1-shRNA

2.2 穩定轉染克隆形成及擴大培養pEGFPBub1-shRNA和pEGFP-C1空質粒轉染A2780細胞，500 mg/L G418加壓篩選后，14 d可見克隆形成，隨后依次轉入24、12和6孔板及培養瓶中擴大培養，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞，95%以上的細胞發出較強的綠色熒光（圖2）。

2.3 Bub1 mRNA在各組細胞中的表達凝膠電泳分析RT-PCR產物，評價各組細胞Bub1 mRNA表達的差異。由圖3可見，pEGFP-C1/A2780組和A2780組細胞459 bp處條帶清晰明亮，而pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組細胞在此處僅出現模糊條帶，相對表達強度（Bub1/GAPDH）分別為0.42±0.03、0.45±0.02及0.11±0.03，轉染組與2個對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 Western印跡法檢測Bub1蛋白水平的表達獲得陽性克隆后，通過Western印跡法驗證3組pEGFP-Bub1-shRNA對Bub1基因的沉默效應，發現包含核心序列1的質粒具有最為明顯的沉默效應，故將其命名為pEGFP-Bub1-shRNA，后續實驗均以該質粒為基礎進行。由圖4可見，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細胞Bub1蛋白相對表達強度（Bub1/β-actin）為0.13±0.04，而對照組pEGFP-C1/A2780和A2780細胞中的Bub1蛋白相對表達強度分別為0.58±0.03和0.60±0.02，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細胞Bub1蛋白表達水平較其他2組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 轉染pEGFP-Bub1-shRNA質粒后各組細胞的紫杉醇敏感性如圖5所示，pEGFPBub1-shRNA/A2780組細胞在不同濃度紫杉醇作用下的生長抑制率均明顯低于pEGFP-C1/A2780細胞，2組間的差異具有統計學意義（P＜0.05），而pEGFP-C1/A2780和A2780細胞之間差異無統計學意義；同時，以紫杉醇作用24及48 h，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組細胞的凋亡率均顯著低于其他2組（圖6），差異均具有統計學意義（P＜0.05）；pEGFP-C1/A2780和A2780細胞的生長抑制率和凋亡率相比差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖 2 pEGFP-C1和pEGFP-Bub1-shRNA轉染A2780細胞穩定表達Fig. 2 The stable expression of pEGFP-C1 and pEGFPBub1-shRNA plasmids transfected in A2780 cells observed by f l uorescent microscope (×40)

圖 3 RT-PCR檢測各組細胞Bub1 mRNA表達的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 3 Bub1 mRNA expression in different cells by RTPCR agarose gel electrophoresis

圖 4 Western印跡法檢測各組細胞中Bub1蛋白的表達Fig.4 Bub1 protein expression in different cells by Western blotting

圖 5 不同濃度紫杉醇處理后各組細胞的生長抑制率Fig. 5 The rates of proliferation inhibition treated with paclitaxel in different concentrations

2.6 轉染Bub1后細胞周期的變化由圖7可見，在紫杉醇濃度為1 μmol/L時，阻滯于G2/M期的細胞比例最高，故選用該濃度進行細胞周期的相關實驗。由圖8及表1可見，1 μmol/L紫杉醇處理24 h后，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組細胞的G0/G1、G1/S及G2/M期細胞的比例分別為（37.1±3.2）%、（24.6±4.4）%和（38.7±2.2）%，而轉染空質粒組相應的比例為（13.3±1.6）%、（14.2±2.3）%和（73.4±5.8）%。由以上數據可以看出，轉染pEGFP-Bub1-shRNA質粒后，G2/M期細胞比例明顯降低，2組間差異有統計學意義（P＜0.05）；而S期細胞比例增加，2組間差異亦具有統計學意義（P＜0.05）。pEGFP-C1/A2780組與A2780組之間則差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖 6 紫杉醇處理后不同時間點各組細胞凋亡率Fig. 6 The rate of apoptotic cells in different groups treated with paclitaxel for different hours

2.7 分裂指數1 μmol/L紫杉醇處理各組細胞24 h，pEGFP-C1/A2780組的分裂指數為（77.8±5.8）%，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組為（33.6±5.8）%，2組間差異有統計學意義（P＜0.05）。而pEGFP-C1/A2780與A2780組之間的差異則無統計學意義（P＞0.05）。

圖 7 A2780細胞經不同濃度紫杉醇處理24 h后的G2/M期細胞比例Fig. 7 The rates of G2/M phase A2780 cells treated with paclitaxel by different concentrations for 24 h

圖 8 流式細胞術檢測細胞周期的變化Fig. 8 Detection of the diversity of growth phase by f l ow cytometry

表 1 紫杉醇處理24 h后各組細胞的周期分析Tab. 1 The analysis of cell cycle for different cell group treated with paclitaxel for 24 h(±s, %)

表 1 紫杉醇處理24 h后各組細胞的周期分析Tab. 1 The analysis of cell cycle for different cell group treated with paclitaxel for 24 h(±s, %)

*: P＜0.05, compared with pEGFP-C1/A2780.

Cell cycle G0/G1 S G2/M A2780 12.6±1.5 17.9±2.4 71.4±6.7 pEGFP-C1/A2780 13.3±1.6 14.2±2.3 73.4±5.8 pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 37.1±3.2* 24.6±4.4* 38.7±2.2*Group

3 討 論

化療是治療中、晚期卵巢癌綜合治療必需的手段之一。雖然在接受傳統治療的初期，卵巢癌對化療藥物的反應較為敏感，但因為易產生耐藥，故而遠期療效欠佳。有研究提示，紫杉醇類藥物發揮作用須依賴于功能完整的紡錘體檢查點［3］，有缺陷的紡錘體檢查點不能將細胞阻滯于G2/M期進而減少細胞凋亡。紡錘體檢查點，是指細胞在長期的進化過程中產生的一套監控紡錘體形態、染色體排列、染色體著絲粒與微管聯接及其張力、確保姐妹染色單體精確分離的質控機制［4］。Bub1既是后期促進復合體APC的抑制劑［5］，亦是其底物。Bub1對于Bub3、BubR1及Mad2等紡錘體組分均具有調控作用［6］，是紡錘體信號轉導和染色體排列所必需的［7］。廣泛的臨床樣本檢測提示紡錘體檢查點基因突變在實體瘤中較罕見［8］，但另一方面，蛋白水平異常導致的紡錘體檢查點功能缺陷卻時有發生。Shichiri等［9］發現：在結直腸癌組織中，Bub1表達水平明顯高于鄰近的正常組織。Grabsch等［10］的研究結果提示，胃癌組織Bub1 mRNA顯著高表達，且其表達水平與腫瘤細胞的增殖呈相關關系。國內亦有關于Bub1表達的研究，如李剛強等［11］就通過免疫組織化學檢測發現：Bubl蛋白的表達水平與乳腺癌復發密切相關。

本研究運用小RNA干擾技術特異性干擾人卵巢癌細胞A2780中Bub1 mRNA及蛋白表達水平，隨后用不同濃度的紫杉醇進行處理，MTT結果提示：Bub1基因的下調能導致A2780細胞紫杉醇敏感性的降低，而這與既往研究結果相一致［12］。此后，通過流式細胞分析，本研究發現：紫杉醇處理24 h后，與對照組相比，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780組G2/M期細胞比例顯著降低，而G0/G1及S期細胞比例增加。同時，Hoechst33342染色結果提示：在轉染pEGFP-Bub1-shRNA質粒后，紫杉醇處理24 h，細胞分裂指數明顯降低，該實驗為上述細胞周期分析提供佐證。以上2個實驗證明，在沉默Bub1基因后，被阻滯于G2/M期的細胞明顯減少。當轉染pEGFP-Bub1-shRNA質粒后，pEGFP-Bub1-shRNA/A2780細胞的凋亡率也相應降低。由此，筆者推測是由于Bub1基因表達下調使紡錘體檢查點失活，進而導致在紫杉醇作用時，阻滯于G2/M期的細胞減少，成功逃逸G2/M期阻滯的這群細胞繼續進入周期循環中而得以存活。

紡錘體檢查點功能缺陷在腫瘤發生發展中的確切作用及其組分對惡性腫瘤微管抑制劑敏感性的影響，需要科研工作者對紡錘體檢查點進行深入細致的研究。只有深入了解腫瘤細胞內在的抵御機制，才能充分發揮藥物的殺傷作用，最終為人類惡性腫瘤的防治提供新的策略。

［1］傅云峰, 謝幸, 葉大風. 腫瘤與紡錘體檢查點的研究現狀［J］. 國外醫學·腫瘤學分冊, 2005, 32(1): 3-6.

［2］Bergstralh DT, Ting JPY. Microtubule stabilizing agents:their molecular signaling consequences and the potential for enhancement by drug combination ［J］. Cancer Treat Rev,2006, 32(3): 166-179.

［3］Sudo T, Nitta M, Saya H, et al. Dependence of paclitaxel sensitivity on a functional spindle assembly checkpoint ［J］.Cancer Res, 2004, 64(7): 2502-2508.

［4］Wassmann K, Benezra R. Mitotic checkpoints: from yeast to cancer ［J］. Curr Opin Genet Dev, 2001, 11(1): 83-90.

［5］Tang Z, Shu H, Oncel D, et al. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint ［J］. Mol Cell, 2004, 16(3): 387-397.

［6］Bharadwaj R, Yu H. The spindle checkpoint, aneuploidy, and cancer ［J］. Oncogene, 2004, 23(11): 2016-2027.

［7］Klebig C, Korinth D, Meraldi P. Bub1 regulates chromosome segregation in a kinetochore-independent manner ［J］. J Cell Biol, 2009, 185(5): 841-858.

［8］Lopes CS, Sunkel CE. The spindle checkpoint: from normal cell division to tumorigenesis ［J］. Arch Med Res, 2003,34(3): 155-165.

［9］Shichiri M, Yoshinaga K, Hisatomi H, et al. Genetic and epigenetic inactivation of mitotic checkpoint genes hBUB1 and hBUBR1 and their relationship to survival ［J］. Cancer Res, 2002, 62(1): 13-17.

［10］Grabsch H, Takeno S, Parsons WJ, et al. Overexpression of the mitotic checkpoint genes BUB1, BUBR1, and BUB3 in gastric cancer-association with tumour cell proliferation ［J］. J Pathol, 2003, 200(1): 16-22.

［11］李剛強, 周海亞, 朱瑞. 乳腺癌組織中Bub1和p53的表達與意義［J］. 中華腫瘤防治雜志, 2007, 14(9): 683-685.

［12］Schliekelman M, Cowley DO, O’Quinn R, et al. Impaired Bub1 function in vivo compromises tension-dependent checkpoint function leading to aneuploidy and tumorigenesis ［J］.Cancer Res, 2009, 69(1): 45-54.

Effects of pEGFP-Bub1-shRNA plasmid on cell cycle and paclitaxel -sensitivity in human ovarian cancer ceIl line A2780

ZHOU Ting,WENG Dan-hui,WANG Shi-xuan,LU Yun-ping,MA Ding(Department of Department of Obstetrics and Gynecology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei, 430030, China)

WANG Shi-xuan E-mail：sxwang@tjh.tjmu.edu.cn

Background and purpose：Previous studies have shown that Bub1 was a critical component of the spindle checkpoint. Paclitaxel sensitivity was considered to be dependent on the functionality of this spindle checkpoint. This study investigated the effects of pEGFP-Bub1-shRNA plasmid stably transfected into the cell cycle and its sensitivity in human ovarian cancer cell line A2780.Methods：After the pEGFP-Bub1-shRNA plasmid and empty plasmids were constructed, they were transfected into A2780 cells by the Lipofectamine 2000TM. The nontransfected cells were the control. RT-PCR and Western blotting were used to determine the target gene and protein expression. The rate of proliferation inhibition was tested by an MTT assay, apoptosis and cell cycles were determined by flow cytometry, and the mitotic index was determined by Hoechst33342 dye.Results：RT-PCR and Western blotting showed that pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group displayed a low expression of Bub1 compared to the A2780 and pEGFP-C1/A2780 group (P＜0.05). The sensitivity of the pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group was significantly lower than the non-transfected and pEGFP-C1/A2780 cells (P＜0.05). Flow cytometry revealed that the rates of G2/M phase and apoptosis were significantly lower in the pEGFP-Bub1-shRNA/A2780 group than those in the control group(P＜0.05).Conclusion：Bub1 plays an important role in the paclitaxel treatment. A down-regulation of Bub1 could reduce the drug sensitivity and rate of G2/M cells in human ovarian cancer cell line A2780.

ovarian cancer; Bub1; paclitaxel; resistance

R73-36+1

A

1007-3639(2010)03-0161-06

國家海外青年學者合作研究基金項目（項目編號：30528012）；國家973重點基礎研究發展計劃資助項目（項目編號：2009CB521800）。

王世宣 E-mail:sxwang@tjh.tjmu.edu.cn

2009-12-10

2010-02-01）