酶法制備大豆多肽的研究

呂育新

（哈高科大豆食品有限責任公司，哈爾濱150086）

大豆蛋白與乳、肉和雞蛋等動物蛋白相比具有較高的價格優勢，但由于大豆蛋白質分子結構復雜，分子量較大，分子高度壓縮、折疊，從而使其消化率和生物效價遠不及動物蛋白。

蛋白質的酶解是改善蛋白質特性的一種很好的方式，大豆蛋白質經蛋白酶水解后生成大豆多肽和大豆寡肽，更易被人體消化吸收；另外，大豆肽還具有多種生理功能和較高的營養價值。因此，大豆蛋白水解物通過選擇不同種類的蛋白酶、控制水解度的大小，可以得到具有不同生理活性的肽，這一領域是目前國內外研究的熱點［1-3］。本實驗確定了Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白的最佳條件，提出了采用Alcalase酶和Flavourzyme酶雙酶法分步酶解工藝來生產低苦味大豆多肽的方法，并得到了分子量不同的多肽產物。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗材料

大豆蛋白（哈高科大豆食品有限責任公司）、Alcalase酶（丹麥 NovoNordisk公司提供）、Flavourzyme酶（丹麥NovoNordisk公司提供）

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法 Alcalase蛋白酶的酶活力測定方法：參照QB/T1803-1993蛋白酶活力的測定方法；

Flavourzyme風味酶活力測定方法：參照QB/T1803-1993蛋白酶活力的測定方法；

DH值(水解度)測定方法：采用pH-stat法，計算公式為：

式中：B為消耗堿量；

N為NaOH摩爾濃度；

α為大豆蛋白氨基的平均解離度0.44；

h為每克蛋白質底物具有的肽鍵毫摩爾數，對于大豆蛋白h=7175。

氨基酸態氮的測定方法：參照ZBX66014-87。

1.2.2 大豆蛋白預處理 大豆蛋白溶液在90℃溫度下加熱處理約10min，使大豆蛋白致密的立體結構變得松散，有利于提高大豆蛋白的酶解速率。

1.2.3 大豆蛋白的酶解反應操作 稱取大豆蛋白加入適量水配制成一定濃度的大豆蛋白溶液，經恒溫水浴預處理后，調節溫度至反應溫度，根據文獻［4，5］，調節pH值至該反應的最適pH值8.0，加入一定量Alcalase堿性蛋白酶，在反應溫度下進行恒溫酶解，酶解過程中要不斷攪拌，同時滴加0.1mol/L的NaOH溶液以保持反應體系pH值恒定，反應偏差一般控制在±0.1。每隔15min記錄NaOH用量，并以水解度加以比較，待水解結束后在攪拌條件下迅速升溫至90℃滅酶，酶解液用于Flavourzyme風味酶的酶解研究。

1.2.4 利用單因素試驗確定水解條件

1.2.4.1 水解溫度的確定 在底物濃度為6%，酶與底物濃度比為2%不變的情況下，水解溫度分別為40℃，50℃，60℃，70℃，水解大豆蛋白 120min；以水解度為評價指標確定最佳的水解溫度。

1.2.4.2 底物濃度的確定 在上述最佳的水解溫度條件下，酶與底物濃度比為2%，底物濃度分別為4%，6%，8%的情況下水解大豆蛋白120min；以水解度為評價指標確定最佳的底物濃度。

1.2.4.3 酶與底物濃度比的確定 在上述最佳溫度和底物濃度的條件下，酶與底物濃度比分別為2%、4%、6%的情況下水解大豆蛋白120min；以水解度為評價指標確定最佳的酶與底物濃度比。

1.2.5 Flavourzyme風味酶的酶解 當大豆蛋白水解反應后，得到淺棕色半透明液體。該溶液呈現出苦味。采用Flavourzyme酶繼續水解8h，可以有效的減少水解液的苦味，水解完成后冷卻用4000r/min的轉速離心10min，取上清液于試管中，置冰箱中備用。

1.2.6 水解產物肽分子量的確定

1.2.6.1 測定條件 紫外檢測波長為280nm，洗脫液的pH值為4.0，用0.0175mol/L磷酸二氫鈉加入0.1mol/L HCl進行調節，流速為0.4mL/min，加入樣量為0.6mL。

1.2.6.2 分析方法 取已經預處理好的交聯葡萄糖凝膠（G25）裝柱，并用洗脫液處理2個柱體積后，然后加入樣品0.4mL，用記錄儀記錄其流出吸收情況，計算出相應的流出體積。

分別取氧化型谷胱甘肽（Mw=612），維生素(B12=1355)，胰島素(Mw=5733）1mg，溶于 5mL 洗脫液中，按上述操作進行分析，并確定各種物質最大吸收峰時洗脫液的流出體積（mL）。

以氧化型谷胱甘肽（Mw=612），維生素(B12=1355)，胰島素(Mw=5733）為分子量參照物，以各種物質分子量對數值為縱坐標（lgM），最大吸收峰時洗脫液的流出體積（mL）為橫坐標做標準曲線，稱取水解產物干品50mg，用蒸餾水定容到5mL，過葡聚糖凝膠(Sephadex G-25)柱，用記錄儀記錄其流出液吸收情況，計算出相應的流出體積。根據標準曲線求出相應的分子量。

2 實驗結果與分析

2.1 Alcalase酶和Flavourzyme風味酶的酶活

Alcalase酶的酶活：6.9×104U/g；Flavourzyme風味酶的酶活：1.4×104U/g

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 溫度對水解度的影響 本試驗在底物濃度為6%，酶與底物濃度比為2%不變的條件下，控制水解溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃，在pH值8.0±0.1條件下水解120min。

從實驗數據中可看出水解度與水解溫度呈正相關，在70℃時水解度達到最大。但由于在70℃時水解過快，pH下降也很快，很難使pH值維持在8.0±0.1，另外根據Alcalase堿性蛋白酶酶學特性，如果溫度繼續升高，高溫會使酶失活，導致蛋白酶水解能力下降，由此確定Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白的最適溫度為60℃。

2.2.2 底物濃度對水解度的影響 控制水解溫度為60℃，酶與底物濃度比2%不變，維持水解液的pH 8.0±0.1，采用的底物濃度分別為4%、6%、8%，水解大豆蛋白120min。以大豆蛋白的水解度為指標，確定Alcalase堿性蛋白酶單酶水解大豆蛋白的最佳底物濃度。

由實驗結果可知，在相同的水解時間條件下，底物濃度越低水解度越大。這是由于底物濃度過高，體系流動性差，不利于酶與底物的接觸。因此，認為底物濃度為4%時效果較好。

2.2.3 酶與底物濃度比對水解效果的影響 控制水解溫度60℃，大豆蛋白水解溶液pH 8.0±0.1，底物濃度4%，采用酶與底物比分別為2%、4%、6%的條件下進行水解，水解120min。以大豆蛋白的水解度為指標，確定最佳的酶與底物濃度比。

由實驗結果可知，雖然酶與底物比為6%時，蛋白質的水解程度最大，但是6%的酶與底物比生產成本較高。當反應達到平衡時，酶與底物比為2%和4%時的水解度僅比6%時小約5%。因此，從生產成本上考慮，選用酶與底物比為2%。

2.3 水解產物的分子量確定

2.3.1 標準曲線的制備 各種標準樣品的分子量與最大洗脫體積見附表，并按最大洗脫體積對各物質分子量的對數值（l gM）作圖，得到標準曲線（見圖1）。

附表 標準分子量的流出體積

圖1 標準曲線

2.3.2 水解產物的分子量分析 取經過Flavourzyme酶水解4h、8h的水解產物上清液各2mL，過葡聚糖凝膠（SephadexG-25）柱，用記錄儀記錄其流出液吸收情況，記錄最大洗脫體積出現時的時間，則最大洗脫體積可以通過洗脫流速與洗脫時間的乘積求得。

圖2 水解4h產物洗脫時間分布圖

圖3 水解8h產物洗脫時間分布圖

分析條件為：檢測波長280nm，洗脫液：pH=4.0的磷酸緩沖液，流速：0.4mL/min，溫度：室溫，加樣量：5mL。

兩組溶液分別得到的最大洗脫時間如圖2、圖3所示，并由上述標準曲線求得所得肽的分子量，比較Flavourzyme酶水解時間對產物分子量的影響。

由圖2和圖3可知，隨著水解時間的延長，水解程度的加深，肽平均分子量逐漸降低，說明水解度增大后，大肽分子數量減少，使肽平均分子量降低。當水解4h時，得到三種肽的出峰時間，分別約為120、150和 160min，肽分子量分別約為 471、2858、2425；當水解8h后，所得多肽的最大出峰時間約為149min，肽分子量約為2865，其余小肽出峰不明顯，說明隨著水解時間的延長，水解產物分子量變小，水解得更徹底，這時候大豆多肽多以寡肽形式存在，易于被人體消化吸收。

3 小結

（1）Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白的較佳條件為：Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白的最適溫度為60℃；底物濃度為4%；酶與底物比為2%。

（2）向上述水解反應后的水解液中加入560U/g的Flavourzyme酶，實驗結果發現：隨著水解時間的延長水解液中氨基酸態氮含量增加，根據感觀評定，水解液苦味變淡。

（3）通過對水解產物的分子量分析，實驗結果發現：隨著水解時間的延長，水解產物分子量變小，水解得更徹底，這時候大豆多肽多以寡肽形式存在。

［1］劉健敏，鐘芳，麻建國.大豆生理活性肽的研究(1)-酶法水解的工藝［J］.無錫輕工大學學報，2004，3:41-45.

［2］安毅，張君文.大豆蛋白活性肽在功能性食品中的應用及發展前景［J］.大豆通報，2004，4:27-29.

［3］陳成.大豆蛋白活性肽保健功能性的研究［J］.大豆通報，2005，2:22-24.

［4］孫旸，陳光，劉艷秋.Alcalase堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究［J］.吉林農業大學學報，2005，2:162-166.

［5］吳建中，趙謀明，寧正祥，楊曉泉.酶法水解生產大豆多肽研究［J］.糧油加工與食品機械，2003，1:45-47.

［6］郭維靜.玉米蛋白水解制取玉米肽的研究［C］.大連理工大學碩士學位論文,2006,6.