根癌農桿菌介導CYP1A1轉化菠蘿的研究

何業華，吳會桃，羅吉，方少秋，馬均，盧敏，彭兵，伍成厚

(華南農業大學 園藝植物生物技術研究所，廣東 廣州 510642)

細胞色素P450(cytochrome P450)基因是生物體內的重要代謝基因，它們在生物與環境之間起著重要的聯系作用，被認為是環境基因的典型代表[1].CYP1A1是 P450基因大家族的成員之一，它存在于哺乳動物的肝臟等組織內，其表達產物CYP1A1能催化一系列的多環芳香碳氫化合物，如苯巴芘(benzopyrene)和 3-甲基膽蒽(3-methylchol-anthene)等，生成環氧化合物而解除毒性，也能被平面多環芳香化合物TCDD、二噁咽等誘導，因此，含有CYP1A1的轉基因植物可用于監測或降解環境中難分解性有機污染物質(persistent organic pollutants，簡稱POPs)[1].菠蘿又稱鳳梨(Ananas comosus)，是世界三大熱帶果樹之一，也是重要的觀賞植物和纖維植物，耐干旱瘠薄，生長迅速，因此，將 CYP1A1導入菠蘿中可培育出具有環境凈化功能的新型果樹和觀賞植物.雖有研究者進行過菠蘿遺傳轉化研究[2-3]，但迄今尚未見P450基因轉化菠蘿等果樹的研究報道.筆者以菠蘿愈傷組織為受體，開展了CYP1A1轉化菠蘿的研究，獲得了轉CYP1A1的轉基因菠蘿植株，旨在以該基因提高菠蘿對本身及土壤中殘留農藥等POPs的降解能力.

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菠蘿品種為神灣(Ananas comosus cv.Shenwan)，采自華南農業大學園藝學院果園，取吸芽作為外植體.

含有人類 CYP1A1的植物表達重組質粒(pUHA1-CYP1A1)和大腸桿菌重組質粒(pUHA1-CYP1A1)分別保存在根癌農桿菌(LBA4404菌株)和大腸桿菌(JM109菌株)中，－70 ℃貯存.質粒、農桿菌菌株和大腸桿菌菌株均由日本神戶大學基因研究中心(Research Center for Environmental Genomics，Kobe University)贈送.

1.2 方 法

1.2.1 愈傷組織誘導和增殖培養

按照何業華等[4]的方法，取菠蘿吸芽在MS+2.0 mg/L BA+3.0 mg/L NAA 上誘導愈傷組織， 切下該愈傷組織轉到增殖培養基 MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA 上增殖.培養條件為：溫度(26±2)℃，每天光照14 h，光照度2 000～3 000 lx.

1.2.2 植株轉化

轉化方法主要參照文獻[5].劃線培養含有pUHA1-CYP1A1的根癌農桿菌 LBA4404，挑選單菌落接種于YEB液體培養基中，在28 ℃下振蕩培養過夜，將其菌液稀釋至D600nm為0.5 左右.將受體愈傷組織切分成0.5 mm大小，在MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA上預培養2 d.將愈傷組織在農桿菌菌液中浸泡5 min，以無菌濾紙迅速吸干受體材料上多余的菌液，植于 MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+100 μmol/L AS (acetosyringone，乙酰丁香酮)上于黑暗中共培養 3 d，然后轉入 MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+20 mg/L Km+400 mg/L Carb上進行選擇分化培養(每天光照時間16 h，光照度2 000 lx ).約28 d 后，將抗卡那霉素(Km)的綠色不定芽切下，轉接在 MS+2.0 mg/L NAA+30 mg/L Km+300 mg/L Carb上選擇2 代.將綠芽轉入MS+1.0 mg/L IBA+30 mg/L Km上生根成苗.每批次浸泡處理約500塊左右愈傷組織，連續3次進行選擇培養.

選擇率=(綠芽數/本輪選擇不定芽總數)×100%.

累積選擇率=(本輪選擇所得綠芽數/初代選擇時的不定芽總數)×100%.

1.2.3 抗性植株的分子檢測

分別取0.2 g轉化植株和非轉化植株葉片，采用CTAB法提取DNA.根據CYP1A1中一段長約400 bp序列設計 1對特異引物.上游引物 P1：5′-GCCAAGCTTTATAACAATGC-3′；下游引物 P2：5′-AAGGACATGCTCTGACCATT-3′(由上海生物工程公司合成).25 μL PCR反應體系包括2 μmoL/L的引物 P1和引物 P2各 2.5 μL，10×Buffer(with MgCl2)2.5 μL，10 μmol/L dNTPs 0.5 μL，0.7 U Taq酶.反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，進行38個循環，72 ℃延伸10 min.PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

按上述步驟進行PCR，擴增出的片段經電泳后轉膜，用重組質粒(pUHA1-CYP1A1 )PCR 產物回收的CYP1A1片段，按DIG DNA Labeling and Detection Kit使用說明制備探針.根據文獻[6]進行Southern雜交驗證.

2 結果與分析

2.1 Km對菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響

菠蘿對 Km比較敏感，但也具一定的耐受能力.將愈傷組織接種在含不同質量濃度Km的分化培養基(以瓊脂為凝固劑)中發現，當培養基中 Km質量濃度在10 mg/L時，分化出的不定芽中白化芽只占27.6%，仍有72.4%的不定芽顯現綠色；但當Km質量濃度升高到15 mg/L時，分化出的不定芽已全部都是白化芽(圖1，表1).

圖1 Km對菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響Fig.1 Influence of Km on adventitious shoots differentiation of pineapple callus

表1 Km對菠蘿愈傷組織不定芽分化的影響Table 1 Influence of Km on adventitious shoots differentiation of pineapple callus

Km對愈傷組織不定芽分化的抑制作用隨質量濃度的升高而加大，當Km質量濃度為50 mg/L時不定芽分化已基本被抑制(表1).為了保證較高的分化率和減少假陽性植株，增強選擇培養時的篩選效果，將初次選擇轉化體時的Km質量濃度確定為20 mg/L；從第2輪開始，隨著轉化芽的長大，將選擇培養基中Km質量濃度加大至30～50 mg/L.試驗中還發現，菠蘿不定芽對Km的耐受性隨培養基凝固劑的不同而異，在成分相同的培養基中，用卡拉膠作培養基凝固劑時，即使Km質量濃度達50 mg/L，愈傷組織所分化的不定芽也都生長正常，綠芽率達100%，Km發揮不出選擇作用(表1).

2.2 轉化植株的獲得

分4批轉化了2 090塊愈傷組織，經過連續3輪的選擇，獲得了97株抗Km植株(圖2).由表2不同批次轉化體的選擇情況可知，不同批次間的轉化率差異比較大，第3輪選擇后的最終轉化率(累積選擇率)為 0.12%～2.69%，表現出較大的隨機性(圖2-a、圖 2-b).

圖2 CYP1A1菠蘿轉化體的選擇Fig.2 Selection of pineapple CYP1A1 transformants

表2 不同批次的轉化體選擇情況Table 2 Transformants selection of different groups

第1輪選擇培養時，不定芽分化系數一般在3以上，不定芽高1～5 mm，具2～5枚肉眼可辨別的葉片，綠芽(Km抗性芽)率 0.75%～17.41%，其Km抗性芽率差異極顯著.一些較大的不定芽(高度 4 mm 以上)中綠芽所占比例較高，較小的不定芽(高度2 mm以下)綠芽數極少，這可能是較大的不定芽在農桿菌侵染之前就已形成芽原基，對Km抗性較強，并非真正的轉化芽，而較小的不定芽是農桿菌侵染之后2～3周形成的，所以，綠芽數少.為消除侵染時受體材料造成的這種誤差，在第 2、3輪選擇培養繼代時采取了如下3項措施：一是將第1輪選擇得到的綠芽葉全部切除，只保留莖尖，使其在選擇過程中重新萌發新葉；其次是使用不定芽生長培養基(不含BA)，防止不定芽繼續分化，以減少分化對選擇過程的干擾；第三是提高Km質量濃度至30 mg/L，以加大選擇壓力.這樣，在第2輪選擇培養結束后，第1輪中的大部分假陽性植株因還原為白色植株而被清除掉，淘汰率 63%～78%；第 3輪選擇時選擇率已在50%以上，此時各批次之間的差異已不顯著.

第3輪選擇培養結束后，將抗性芽轉移至生根培養基中，當培養至植株具 8枚以上長度約 3 cm的葉、5條以上長度大于1 cm的根時，即可進行煉苗移栽.移栽后轉化苗能正常生長(圖2-c)，但不同植株之間長勢差異較大.

2.3 Km抗性植株的分子檢測

分別從7個獨立轉化批次中隨機抽取2株Km抗性植株，用CYP1A1特異引物對其基因組DNA進行PCR擴增，所取的14 株Km抗性中有9株擴增出了目的片段，分別是圖3-a中的第1、2、3、5、6、9、11、13、14號株，PCR陽性率達64.29%.對6株PCR陽性植株進行了Southern雜交分析，結果表明，其中只有1株(4號)與野生型植株(陰性對照)一樣無雜交信號，為假陽性植株，其他5株(1、2、3、5、6號)PCR陽性植株獲得了與重組質粒(陽性對照)大小相同的雜交信號，表明為轉基因植株（圖3-b).

圖3 CYP1A1菠蘿轉化體的分子生物學鑒定Fig.3 Detection in molecular biology of pineapple CYP1A1 transformants

3 結論與討論

將預培養2 d后菠蘿愈傷組織經含植物表達重組質粒(pUHA1-CYP1A1)的根癌農桿菌(LBA4404菌株)侵染后，在含有100 μmol/L AS的瓊脂上共培養3 d，轉入選擇培養基(MS+3.0 mg/L BA+2.0 mg/L NAA+20 mg/L Km+400 mg/L Carb+8 g/L agar)上選擇培養；將得到的綠色不定芽轉入 MS+2.0 mg/L NAA+30 mg/L Km+300 mg/L Carb+8 g/L agar上再進行連續2輪選擇，除去其中的假抗性芽；最后將綠芽轉入 MS+1.0 mg/L IBA+30 mg/L Km+8 g/L agar上生根，共獲得95株Km抗性植株，最高轉化率可達2.69%.對其中部分抗Km植株進行PCR檢測，PCR陽性植株率達64.29%.經 Southern雜交，進一步證實 CYP1A1基因已整合到菠蘿基因中.以瓊脂為培養基凝固劑、共培養基中添加AS、增加選擇次數和逐漸增加新一輪選擇培養基中的Km質量濃度等是根癌農桿菌介導菠蘿愈傷組織獲得轉基因植株的重要條件.

npt-Ⅱ是植物遺傳轉化中常用的選擇標記基因，其表達產物氨基糖苷磷酸轉移酶(NPT-Ⅱ)通過酶促磷酸化使氨基葡萄糖苷類抗生素失活，因而含有npt-Ⅱ的轉基因植株具有抗Km或新霉素等氨基葡萄糖苷類抗生素能力，但通常認為npt-Ⅱ對豆科植物和單子葉植物的轉化選擇效果不佳[7].有學者認為npt-Ⅱ是菠蘿適宜的選擇標記基因，但Km不是合適的篩選抗生素[8].本研究結果表明，在以瓊脂作凝固劑時，菠蘿對Km敏感，愈傷組織在含有15 mg/L Km的分化培養基上產生的不定芽全部白化，當Km質量濃度超過50 mg/L時很難分化出不定芽；用卡拉膠作為凝固劑時，50 mg/L Km還不會出現白化苗，甚至100 mg/L Km也只有約20%不定芽白化.其原因可能是卡拉膠中某些組分固定或破壞了Km，使其毒性大為降低.另外，因對Km耐受能力與芽體大小成正比，從第2輪選擇開始應提高培養基中Km的濃度.

菠蘿愈傷組織一旦轉入不定芽選擇分化培養基中，便會不斷分化產生不定芽而嚴重干擾Km抗性芽的選擇過程，因此，在選擇培養繼代過程中，應仔細挑選抗 Km的綠芽，并除去其基部愈傷組織.另外，在抗性芽增殖過程中發現，在所增殖出的新不定芽中，仍有較高比例的白化芽(非抗性芽)產生，這表明以愈傷組織為轉基因受體，經器官發生途經所得到的轉化植株可能是由轉基因細胞和非轉基因細胞組成的轉基因嵌合體植株，因此，筆者擬對以胚性細胞為受體，經體細胞胚再生途徑獲得均質轉基因植株的可能性進行研究.

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