Lj20和St24發酵液粗提物對番茄體內防御性酶活性的影響

武江,馬林,韓巨才,王美琴

(山西農業大學農學院,山西太谷 030801)

Lj20和St24發酵液粗提物對番茄體內防御性酶活性的影響

武江,馬林,韓巨才,王美琴

(山西農業大學農學院,山西太谷 030801)

為明確植物內生放線菌對植物體內防御性酶活性的影響,以植物內生放線菌Lj20和St24發酵液粗提物處理番茄植株,測定其根、莖、葉中過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化。測定結果表明,用Lj20和St24粗提物處理番茄植株后,除SOD處理和對照沒有明顯差異外,CAT、PPO和POD酶的活性都有所增強,但酶活性隨時間變化規律各不相同。其中Lj20粗提物處理的番茄莖和葉中PPO的活性增加最明顯,在測定時間內呈直線上升趨勢。這表明Lj20和St24的代謝物不僅對病原菌具有直接抑制作用,而且可通過提高植物體內防御性酶活性來提高植物的抗病性。

植物內生放線菌;防御性酶活性;番茄植株

植物內生菌是定殖在健康植物組織內,并與植物建立和諧聯合關系的一類微生物,包括內生真菌、內生放線菌和內生細菌[1,2]。自Stierle A等[3]1993年從短葉紫杉中發現產紫杉醇的內生真菌后,有關內生菌的研究引起了人們越來越多的興趣。近年來的大量研究表明,內生菌廣泛存在于絕大多數植物中,開發與應用潛力巨大。其中,放線菌是產生抗生素及多種生物抗性物質的重要微生物資源,廣泛存在于植物體內[4,5]。

隨著有機和綠色食品的發展,利用微生物進行生物防治越來越受到人們的重視,特別是植物抗病性的誘導已成為一個重要的發展方向和現代農藥的新理念[6]。目前,國內外關于植物內生菌在植物病害防治中應用的報道多集中于內生真菌和內生細菌,關于內生放線菌應用報道較少。前期研究工作已證實植物內生放線菌St24和Lj20對番茄灰霉病菌、葉霉病菌等多種病原菌具有抑制作用,盆栽試驗證實具有良好的開發應用前景[7]。為進一步探究內生放線菌的防病機制,本文測定了St24和Lj20代謝物對番茄植株內防御酶活性的影響,為進一步開發該菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物內生放線菌Lj20和St24菌株由山西農業大學農藥學實驗室提供。番茄灰霉病菌為山西農業大學農藥學實驗室保存菌種。

1.2 方法

1.2.1 植株處理

制備濃度為1×105mol?mL-1的灰霉病菌孢子懸浮液,在番茄幼苗三、四葉時接種,30℃保濕光照培養3 d,用St24和Lj20菌株發酵液粗提物葉面噴霧處理,粗提物濃度為500 mg?L-1,在噴霧12 h及 2、4 、6、8 d 后分別測定植株根 、莖、葉的過氧化氫酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,以清水為對照。

1.2.2 酶液提取

準確稱量植物根、莖、葉各0.3 g,冰上剪碎,加0.05 mol?L-1pH6.0的磷酸緩沖液3.0 mL,0.03 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),加少量石英砂,在冰浴中研磨成勻漿,于10000 r?min-14℃離心 10 min,取上清液,即為粗酶液。

1.2.3 酶活性測定

CAT和PPO的測定方法見鄒崎《植物生理生化試驗指導》[8],POD的測定方法見湯章成《現代植物生理學試驗指南》[9],SOD的測定方法見王金勝《農業生物化學研究技術》[10]。

2 結果與分析

2.1 過氧化氫酶(CAT)的活性變化

2.1.1 植株根內CAT的活性變化(圖1)

圖1 Lj20和St24發酵液粗提物對植株根內CAT活性影響Fig.1 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on CAT activity in roots

從圖1可看出,經Lj20發酵液粗提物處理后,番茄植株根中CAT活性在處理當天和處理后4 d的酶活性高于對照,其中處理當天的活性最大,酶活性為2.93 U?g-1。而在其它測定時間內酶活性都小于對照酶活性。經St24發酵液粗提物處理番茄植株根,CAT活性在處理12 h、4 d和6 d時酶活性都高于對照,6 d時達到最高峰,為5.3 U?g-1。到8 d時,兩個處理和對照酶活性相近,差異不顯著。

2.1.2 植株莖內CAT的活性變化(圖2)

圖2 Lj20和St24發酵液粗提物對植株莖內CAT活性影響Fig.2 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on CAT activity in stems

從圖2可以看出,經過Lj20和St24發酵液粗提物處理后,隨時間延長植株莖的酶活性變化都較小。經Lj20發酵液粗提物處理后的番茄植株,莖中的CAT活性只有在處理后6 d時略高于對照組酶活性,在其它測定時間內均小于對照酶活性。而經St24發酵液粗提物處理后,酶活性只有在2 d時低于對照,其它時間都高于對照。

2.1.3 植株葉內CAT的活性變化(圖3)

圖3 Lj20和St24發酵液粗提物對植株葉內CAT活性影響Fig.3 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on CAT activity in leaves

從圖3可以看出,經Lj20發酵液粗提物處理后的番茄植株,葉中的CAT活性在處理當天顯著高于對照,但在之后6 d都低于對照水平,在8 d時略高于對照。經St24發酵液粗提物處理的番茄葉,在處理當天與對照相比無明顯差異,至測定第四天酶活性達峰值,為9.1 U?g-1,且高于對照,而在其它測定時間內都低于對照。

2.2 多酚氧化酶(PPO)的活性變化

2.2.1 植株根內PPO的活性變化(圖4)

圖4 Lj20和 St24發酵液粗提物對植株根內PPO活性影響Fig.4 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on PPO activity in roots

從圖4可以看出,Lj20發酵液粗提物處理番茄后,植株根內PPO活性基本保持平衡,8 d內的變化不大。經St24發酵液粗提物處理后,植株根內的PPO活性在處理前4 d活性變化趨勢與對照相同,在2 d達到最高,且顯著高于對照水平,最大值為120 U?g-1;到6 d時達到另一活性高峰,為90 U?g-1,且明顯高于對照酶活性。

2.2.2 植株莖內PPO的活性變化(圖5)

圖5 Lj20和St24發酵液粗提物對植株莖內PPO活性影響Fig.5 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on PPO activity in stems

從圖5可以看出,用Lj20和St24發酵液粗提物處理植株后,莖內的PPO活性都呈增長趨勢,且Lj20發酵液粗提物處理后 PPO活性始終大于St24發酵液粗提物處理后的酶活性。但在4 d以后兩個處理組都與對照組酶活性接近。

2.2.3 植株葉片內PPO的活性變化(圖6)

圖6 Lj20和St24發酵液粗提物對植株葉內PPO活性影響Fig.6 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on PPO activity in leaves

從圖6可看出,處理組葉片PPO活性在12 h時均低于對照組,到8 d時三組葉片的酶活性接近。Lj20發酵液粗提物處理番茄后,葉片內的PPO活性呈直線上升趨勢,至8 d達到最高,酶活性為38 U?g-1,且略高于對照水平;經St24發酵液粗提物處理后,葉片內的PPO活性迅速增加,在處理2 d達到最高,達到35 U?g-1,且顯著高于對照水平,從處理后4 d開始,活性變化與對照組相同,且略低于對照。

2.3 過氧化物酶(POD)的活性變化

2.3.1 植株根內POD的活性變化(圖7)

圖7 Lj20和St24發酵液粗提物對植株根內POD活性影響Fig.7 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on POD activity in roots

從圖7可以看出,經Lj20發酵液粗提物處理后的番茄植株根內POD酶活性的變化,只有在處理后6 d時低于對照,其它時間都高于對照。經St24發酵液粗提物處理后,番茄植株根中的POD活性都高于對照,在處理當天即達到最大值,為2982.22 U?g-1,在處理后的四天中呈較快下降趨勢,并在第四天降至最低,在隨后的時間中,POD活性持續增加。

2.3.2 植株莖內POD的活性變化(圖8)

圖8 Lj20和St24發酵液粗提物對植株莖內POD活性影響Fig.8 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on POD activity in stems

從圖8可以看出,Lj20發酵液粗提物處理后的番茄植株莖內的 POD酶活性在4 d時活性最低,且低于對照,在處理后的其他時間內都明顯高于對照,處理后8 d時達到最大值,為1 040 U?g-1。St24發酵液粗提物處理的番茄植株莖的POD活性在試驗的前6 d都明顯高于對照,在8 d時,酶活性下降到了對照數值以下。

2.3.3 植株葉內POD的活性變化(圖9)

圖9 Lj20和St24發酵液粗提物對植株葉內POD活性影響Fig.9 Effects of extracts of Lj20和St24 metabolites on POD activity in leaves

由圖9可以看出,Lj20發酵液粗提物處理后的番茄葉中的POD活性在處理前6 d,酶活性變化不大,在6～8 d,酶活性增加,達到最大值316.44 U?g-1。St24發酵液粗提物處理的番茄植株后的酶活性都高于對照酶活性,6 d時活性最大,為562.67 U?g-1。

2.4超氧化物歧化酶(SOD)的活性變化

對照組和處理組根、莖、葉的SOD活性變化相同,說明Lj20和St24發酵液粗提物對植株體內的SOD酶活性沒有影響。

3 結論與討論

寄主植物受到病源菌侵染后,其防御酶系會被激活。植物體內的SOD是一種典型的誘導酶,可以清除O2?-,減少對植物的毒害作用。植物在逆境下受到傷害以及植物對逆境的抵抗能力往往與體內SOD活性水平有關,抗逆性強的植物SOD活性降低幅度小或相對穩定,有時甚至升高。CAT和POD是細胞內保護酶系統的重要組成部分,能有效清除生物體內的過氧化氫對細胞的氧化作用,從而增強植物對各種不良環境的抵抗能力。PPO廣泛存在于植物中,已有研究報道,健康葉片中PPO活性與作物抗病性呈顯著相關。在正常情況下,PPO和底物是分開的,當細胞受到輕微破壞組織衰老時,有些細胞結構解體時,PPO和底物接觸發生反應,將酚氧化成對微生物有毒的醌,可防止植物感染。這些酶的活性變化可反應某一時間段內植物體內代謝的變化情況[11,12]。

本研究結果表明經Lj20和St24發酵液粗提物處理番茄植株后CAT、POD活性均表現出明顯的波動,其中根、莖、葉中CAT活性在處理前期均低于對照,可能是因為細胞受到活性氧的毒害,損害了CAT使其活性下降,但POD在處理后始終保持較高的活性,從而緩解了活性氧對CAT的毒害作用。處理后期CAT、POD活性明顯增強并逐漸達到高峰,此階段CAT、POD在清除H2O2對植物毒害方面發揮重要作用,細胞內O2?-積累很少。

而SOD活性與對照無明顯差異,這可能是由于處理后植物體內的一些可溶性蛋白首先參與到防御系統中,蛋白質含量增加以抵御植物受毒素的傷害,但之后由于外界脅迫時間的增加,毒素濃度逐漸升高,蛋白質合成受阻,同時相對加速了一些儲藏蛋白質的水解使蛋白質含量降低,從而抗逆能力降低,植物體內活性氧含量升高。也可能是PPO活性變化的影響,因為PPO活性在處理后變化比較明顯,一直呈上升趨勢并在第8天達到峰值,說明經Lj20和St24發酵液粗提物處理后植株體內的代謝活動不斷增強,從而提高植物抵抗外界病原菌感染的能力,具體原因有待于進一步分析。

隨著外界脅迫程度的增強,SOD、POD、CAT、PPO相互協調,組成植物體內完善的抗氧化保護系統,使活性氧對細胞的損害程度維持在相對穩定的狀態。本試驗結果表明:經Lj20和St24發酵液粗提物處理后,番茄植株體內各種酶的活性顯著發生變化,說明寄主植物受到病源菌侵染后,其防御酶系被激活,起到調節并恢復植物體內各種生理生化活動的作用,維持植物健康生長。因此,Lj20和St24菌株除對多種病原菌都有很好的抑制作用,在適當的濃度下也可作為激活植物抗病機制的誘導劑,從而提高作物的抗逆能力。有關兩菌株是否具有提高寄主對病原菌侵染的防衛能力有待進一步研究。

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The Effects of Extracts of Lj20 and St24 Metabolites on the Protective Enzyme Activities in Tomato Plants

WU Jiang,MA Lin,HAN Ju-cai,Wang Mei-qin
(College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)

The protective enzyme activities in roots,stems and leaves of tomato seedlings were detected after treatment with extracts of endophytic actinomycetes St24 and Lj20 metabolites.The results showed that extracts of St24 and Lj20 metabolites could obviously increase the activities of PPO,POD and CAT except that of SOD,but the regularities for change of three enzymes were different with time.The effect of Lj20 metabolites extracts on PPO in stem and leaf was greatest.After treatment,the activity showed an upward trend in a straight line.Therefore,it is considered that the metabolites of St24 and Lj20 can not only directly inhibit pathogens,but also improve the disease resistance of tomato seedlings to a certain extent by prompting the activity of protective enzymes.

Endophytic actinomycetes;Protective enzyme activities;Tomato seedlings

S432.4+3

A

1671-8151(2010)01-0024-05

2009-09-07

2009-12-04

武江(1984-),女(漢),山西太原人,碩士研究生,主要從事園藝植物病害方面的研究。

韓巨才,教授,博士生導師。E-mail:sxndhjc@yahoo.com.cn

山西省自然基金(2008011066);山西省科技攻關項目(2007031039);山西省留學歸國基金(2007061,2009043)

(編輯:馬榮博)