新鮮鹿糞便中捕食線蟲真菌的分離和鑒定

楊 琳，楊曉燕，李云霞，蘇鴻雁

（大理學院農學與生物科學學院，云南大理 671003）

新鮮鹿糞便中捕食線蟲真菌的分離和鑒定

楊 琳，楊曉燕，李云霞，蘇鴻雁*

（大理學院農學與生物科學學院，云南大理 671003）

從100份新鮮鹿糞樣中分離到4種捕食線蟲真菌，通過對其孢子著生方式、孢子形狀、捕食器官等形態學觀察，鑒定為節叢孢屬（Arthrobotrys）的少孢節叢孢（A.oligospora）和彎孢節叢孢（A.musiformis），單頂孢屬（Monacrosporium）的橢圓單頂孢（M.ellipososporum）和白色單頂孢（M.candidum）。

捕食線蟲真菌；分離；鑒定；鹿糞

家畜寄生線蟲可對畜牧業造成嚴重的損失，對病原線蟲的生物防治一直被認為是安全、有效的措施之一。家畜寄生線蟲種類繁多，據不完全統計，在青海危害反芻家畜的線蟲種類達85種，其中肺線蟲13種，消化道線蟲71種，橫紋肌寄生線蟲1種，經濟損失十分嚴重〔1〕。單是侵染青海省牦牛的寄生線蟲就有乳突類圓線蟲（Strongyloides papillosus）、陜西夏柏特線蟲（Chabertia Shanxiensis）、和田古柏線蟲（Cooperia hetianensis）、羊夏伯特線蟲（Chabertia ovina）、捻轉血矛線蟲（Haemonchus contortus）、粗紋食道口線蟲（Oesophagostomum.asperum）等40余種〔1〕。

多年來，對家畜線蟲病的防治主要以化學藥物防治和合理的放牧管理為主?；瘜W藥物進行防治副作用較大，寄生線蟲對化學驅蟲劑抗藥性的日益顯現，已經成為防治中需要解決的關鍵問題〔2〕；藥物殘留以及藥物代謝產物對生態環境有嚴重的負面影響，而且多數化學藥物僅對成蟲起作用，對蟲卵及幼蟲無能為力。目前，在研發新型化學驅蟲劑的同時，尋找其它替代防治方法日益受到重視，其中，生物防治（簡稱生防）被認為是最有效和環保的措施之一。

在自然界中廣泛分布有一類被稱為捕食線蟲真菌（nematode-trapping fungi）的線蟲天敵，其可以通過菌絲特化形成各種捕食結構（捕食器，traping device）捕食線蟲，是目前研發寄生線蟲生防制劑的重要資源〔3〕。利用捕食線蟲真菌對線蟲感染進行控制是一種高新生物防治技術，利用線蟲天敵進行生物防治具有無污染、無殘留、不易產生抗藥性等優點。其特點是對線蟲的幼蟲起作用，在其感染動物之前就將其殺死，避免了家畜的感染或重復感染〔4〕。在一些畜牧業發達的國家如新西蘭，澳大利亞等，利用食線蟲真菌防治動物寄生線蟲病取得了一定進展〔5-7〕。其中，捕食線蟲真菌（Athrobotrys flagrans）已被開發成生防制劑，在新西蘭〔8〕、瑞典〔9〕、美國〔10〕等國家成功用于防治家畜寄生線蟲。該菌能產生大量厚垣孢子，經動物腸道消化后能成活并捕食糞便中的線蟲。給牧羊、牛服用食線蟲真菌一段時間后，牧場土壤中感染性幼蟲數量顯著降低，從而使放牧家畜的胃腸道寄生蟲數量和糞便中蟲卵數減少，臟器病變減輕，增重獲得較大改善，達到了生物防治線蟲的目的〔11〕。這些研究和實際應用的現狀給我們展示了利用捕食線蟲真菌防治家畜寄生線蟲的巨大潛力。

在家畜寄生線蟲生物防治中，生防菌株既要有較強的浸染力，還需具有較強的抗腸道消化能力。糞便中的捕食線蟲真菌以糞便為營養基質在牧場中生存繁衍，很多種類伴隨動物的取食而進入腸道，又隨糞便排出。因此，從家畜自然糞便中分離的捕食線蟲真菌常常具有很強的抗消化特性〔12〕。對特定牧區寄生線蟲的生物防治，土著生防菌因長期適合本地區自然環境條件而成為首選的評估資源〔4〕，對青藏高原等特殊生境牧區選育適合本地區的生防菌株尤為重要。

生防資源是生物防治的基礎，掌握家畜鮮糞便中捕食線蟲真菌的生態分布規律，鑒定和保存大量的菌株資源，研究生防真菌對線蟲的侵染機理，評估捕食線蟲真菌捕食能力及抗消化能力對于生防制劑的開發和應用非常關鍵。因此，調查這類生物資源在動物糞便中的分布情況，是生物防治家畜寄生性線蟲病的基礎和前提條件〔6，13－14〕。本研究主要是對鹿糞中的捕食線蟲真菌進行調查，研究結果將極大地豐富動物寄生蟲生防資源，為家畜寄生蟲防治提供理論基礎和物質材料。

1 材料與方法

1.1 鹿糞樣 共100份，采自大理州永平縣鹿養殖場。樣品采集方法：采樣時為避免污染，最好是在糞便落地前收集（但如果是已落地的糞便，必須除去表層）。用采樣勺采集40g左右的糞便樣品裝入無菌的塑料封口袋。在自然條件下，2周內處理完所采回的糞便樣品。否則，應放入4℃冰箱內。

1.2 誘餌線蟲 誘餌線蟲的培養：向燕麥片培養基（燕麥片50g裝入250mL三角瓶中，加入60%的水，靜置30min，使燕麥片充分濕潤，121℃滅菌20～30min）接種線蟲（Panagrellus redivivus），28℃培養1周左右，觀察到三角瓶瓶壁上有線蟲爬壁時，4℃冰箱保存備用。

誘餌線蟲的制備：取少許上述培養物于二層擦鏡紙上置于漏斗（漏斗通過軟管與收集管相接），加適量無菌水，擠壓軟管排除氣泡，靜置一定時間，直至濾出物達到需要量，取收集管中的濾出物，離心水洗三次，加無菌水至線蟲濃度約為（2～3）×104條/mL。

1.3 培養基 玉米粉培養基（CMA）：玉米粉30g，瓊脂16g，水1 000mL，自然pH值。玉米粉加水適量煮沸30min，四層紗布過濾，濾液加水至1 000mL，混勻，分裝。121℃滅菌20～30min。主要用于捕捕食線蟲真菌的分離、鑒定。

1.4 分離方法 誘餌平板法：用滅菌牙簽將約2～3g樣品挑到CMA平板上，加入線蟲約5 000條做誘餌，每個樣品三個重復。室溫培養3～4周后，在解剖鏡10～40倍下，對每個平板鏡檢。觀察到捕食線蟲真菌，用無菌牙簽挑取其單個孢子，在酒精燈下迅速轉接到60mmCMA平板上，并用此牙簽在接入孢子地方的附近切掉一小塊約0.5cm×1cm的培養基，形成以后用于觀察捕食器的小觀察室，然后置于25℃培養箱中或室溫培養。

1.5 鑒定方法 利用立體解剖鏡對已產生孢子和捕食器官的真菌進行鑒定；對未產生捕食器官的真菌，則挑單孢子于PDA培養基上進行純化，再轉于低營養的CMA培養基上，用高仁恒等〔15〕及蘇鴻雁等〔16〕的方法誘導捕食器官產生，然后進行鑒定。

2 結果

分離培養結果：共分離到4種捕食線蟲真菌，通過對其著生方式、孢子、捕食器官等的形態學觀察、測定，分別為節叢孢屬（Arthrobotrys）的少孢節叢孢菌（A.oligospora）和彎胞節叢孢菌（A.musiformis），單頂孢屬（Monacrosporium）的橢圓單頂孢（M.ellipososporum）和白色單頂孢（M.candidum）。

3 討論

本實驗從鹿的新鮮糞便中分離出了4種捕食線蟲真菌，其中A.oligospora的分出率為10%；A.musiformis的分出率為8%，M.ellipsosporum的分出率為7%，M.candidum的分出率為2%。此次糞便中捕食線蟲真菌的檢出率和種類與秦澤榮等〔17〕所作的新鮮牛糞中的相似，但比在土樣及陳糞〔18〕中都少，原因是所采樣鹿糞糞樣單一，只是一個養殖場的，飼料單一，干草成分多，青飼料少，再加上由于動物消化道的消化作用和酸、堿、熱等環境，隨食物吃進去的捕食線蟲真菌能抵御消化道惡劣環境并出現在糞便中的頻率不高，同時新鮮糞便未接觸土壤，減少了外界污染的概率。本研究直接從動物的新鮮糞便中分離出的捕食線蟲真菌，理論上講應具有抗消化能力，與從土壤中分離的捕食線蟲真菌菌株相比，更有可能用于動物線蟲病的生防，但需進一步進行生防效果實驗。

〔1〕蔡進忠.青海省反芻家畜寄生線蟲的分類整理〔J〕.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2006，24（S）：68-72.

〔2〕Jackson，F.，Coop，R.L.The developmentofanthelmintic resistance in sheep nematodes〔J〕.Parasitology，2000，141：91-100.

〔3〕張克勤，莫明和.中國真菌志-節叢孢及相關屬〔M〕.北京：科學出版社，2006.

〔4〕楊曉野，楊蓮茹，劉珍蓮，等.捕食線蟲性真菌——少孢節叢孢菌體外殺寄生性線蟲幼蟲的研究〔J〕.畜牧獸醫學報，2004，35（3）：334-338.

〔5〕Larsen，M.，P.Nansen，J.Gronvold，etal.Biological control of trichostroggyles in calves by the fungus Duddingtonia flagrans fed to animals under natural grazing conditions〔J〕.Veterinary Parasitol，1995a，55：266-288.

〔6〕Larsen，M.，P.Nansen，A.Roepstorff，etal.Prospects for biological control of strongyles in horse〔C〕.Proc.XXV World Vet.Cong.，3-9 September，Yorkohama，Japan，1995b：95.

〔7〕Eysker，M.，N.Bakker，Y.A.van der Hall，etal.The impactof daily Duddingtonia flagrans application to lactating ewes on gastrointestinal nematodes infection in their lambs in the Netherlands〔J〕.Veterinary Parasitology，2006，141：91-100.

〔8〕Waghorn，T.S.，Leathwick，D.M.，Hen，L.Y.，et al. Influence of nematophagous fungi，earthworms and dung burialon developmentof the free-living stagesofOsertagia（Tekadirsagua）circumcincta in New Zealand〔J〕.Veterinary Parasitology，2002，104：119-129.

〔9〕Dimander，S.O.，Hogland，J.，Uggla，A.，etal.Evaluation of gastro-intestinal nematode parasite control strategies for first-season grazing cattle in Sweden〔J〕.Veterinary Parasitology，2003，111：193-209.

〔10〕Terril，T.H.，Larsen，M.，Samples，O.，etal.Capbility of the nematode-trapping fungus Duddingtonia flagrans to reduce infective larvae of gastrointestinal nematodes in goat faecesin thesoutheastern United States：does titration and does titration and does time interval studies〔J〕. Veterinary Parasitology，2004，120：285-296.

〔11〕Manueli，P.R.，Waller，P.J.，Faedo，M.，etal.Biological controlofnematodeparasitesof livestock in Fiji：screening of fresh dung of small ruminants for the presence of nematophagous fungi〔J〕.Veterinary Parasitol，1999，81：39-45.

〔12〕徐鑌蕊，秦澤榮，陳剛，等.節叢孢屬捕食線蟲真菌對體外奧斯特線蟲幼蟲的捕食效果〔J〕.中國獸醫雜志，1999，25（2）：8-9.

〔13〕Larsen，M.，M.P.Nansen，J.Wolstrup，etal.In vitro selection ofnematophagous fungi forbiocontrolof parasitic nematodes in ruminants〔J〕.J.Helminthol.，1991，65：193-200.

〔14〕Larsen，M.，M.Faedo，P.J.Waller.The potential of nematophagous fungi to control the free living stages of nematode parasites of sheep：survey for the presence of fungi in fresh faeces of grazing livestock in Australia〔J〕. Vet.Parasit，1994，53：275-281.

〔15〕高仁恒，雷麗萍，劉杏忠.一種誘導和觀察捕捕食線蟲真菌捕食器官的簡易方法〔J〕.真菌學報，1996，15（4）：304-305.

〔16〕蘇鴻雁，李明，劉曉軒.捕捕食線蟲真菌玻片制作方法的改進〔J〕.大理學院學報，2006，5（6）：25-26.

〔17〕秦澤榮，繆作清，李美子，等.新鮮牛糞便中捕食線蟲真菌的分離和鑒定〔J〕.中國獸醫學報，2001，21（1）：58-59.

〔18〕Hongyan Su，Yu｀e Hao，Minghe Mo，etal.The ecology of nematode-trapping hyphomycetes in cattle dung from threeplateau pastures〔J〕.Veterinary Parasitol，2007，144：293－298.

Isolation and Identification of Nematophagous Fungi from Free Faeces of Deer

YANG Lin,YANG Xiaoyan,LIYunxia,SU Hongyan*
（College of Agriculture and Bioscience,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671003，China）

Four strains of nematophagous fungi belonging to Arthrobotrys and Monacrosporium were isolated from fresh faeces of deer in the present study.The fungiwere,respectively,identified as A.oligospora.A.musiformis,M.ellipososporum and M.candidum.. Themorphological features of the isolated fungiwere described in detail.

nematophagous fungi；isolation；identification；faeces of deer

Q938.1

A

1672-2345（2010）10-0040-03

國家自然科學基金資助項目（31060019）

2010-09-19

楊琳，講師，主要從事微生物學和細胞生物學研究.

*通信作者：蘇鴻雁，教授，E-mail：suhongyan16@yahoo.com.cn

（責任編輯 李 明）