Ran調節因子RanBP1的生物學作用

曾 曉，孫露霜，楊立琳，曹允考

（東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030）

Ran（Ras-related Nuclear）是小型的 Ras相關蛋白，Ran在所有已研究過的有機體中都存在，它們是生存所需要的基本物質，對真核細胞中有絲分裂和減數分裂開始和結束的控制，及其間紡錘體的組裝、染色體的正確分配、核膜破裂和重組等都起一定的作用[1]。Ran的作用是在其調節物RanGEF（Guanine Nucleotide Exchange Factors）、RanGAP1（RanGTPase Activating Protein 1）、RanBP1（Ran Binding Protein 1）和 RanBP2（Ran Binding Protein 2）等的調節下，Ran連接的GTP/GDP發生轉換實現的。RanBP1是其中的一個主要調節因子，目前國內外有很多學者對其進行了大量的研究。

RanBP1是Ran家族最小的成員，是第一個被鑒定的Ran結合蛋白，最早是對CG-豐富的序列進行功能篩選中被克隆出來[2]。分子質量為23 ku，由201個氨基酸構成，沒有真正的GAP活性和功能，但可作為GEF抑制器使RCC1失活，間接增加RanGDP變為RanGTP的比值。RanBP1可以被看作是RanGTPase循環中的關鍵調節因子，從酵母到人類都是高度保守的[3]。RanBP1對細胞的一些生物過程：如細胞的核-質運輸、紡錘體的組裝、細胞周期、有絲分裂控制、有絲分裂結束后核重組等都有一定的作用。

1 RanBP1細胞的核質間物質運輸中的作用

真核細胞中離子、小的代謝物和分子質量小于40～60 ku的蛋白質能夠通過核孔復合物（Nuclear Pore Complex，NPC）環繞的水溶性通道來被動擴散。多數分子質量大于40～60 ku的大分子蛋白以主動運輸的形式穿過NPC。許多試驗證明，蛋白質的主動內輸和外運分別是由被稱為核定位信號（Nuclear Localization Signal，NLS）和核外輸信號（Nuclear Export Signal，NES）的短氨基酸片段介導的。大量的研究表明，Ran的調節物在細胞中的空間定位可以使間期時的細胞核內產生高濃度的RanGTP，而細胞質內產生的RanGTP濃度很低并且量是非常有限的，這種核內與核外有較高的RanGTP濃度差是調節核質轉運方向必須的[1]。

RanBP1作為Ran的重要調節因子也在其中起到一定作用。Rexach和Blobel用提純了的重組蛋白來進行連接分析的方法顯示RanGTP能使固定后的核蛋白釋放出由NLS、importinα（內輸蛋白α）和importinβ（內輸蛋白β）構成的復合物，并使NLS/importinα從 importinβ上游離出來。RanGTP和importinβ直接連接，通過與RanBP1相互作用而保持穩定。當RanGTP.importinβ.RanBP1與RanGAP1相作用時，RanBP1可刺激Ran連接的GTP水解成GDP，從而破壞復合物，使RanBP1被釋放出來，從而促進由 RanGDP、importinβ 和 importinα.NLS，以及與內輸因子P10一起裝配成內輸復合物[3]。

相反，富含亮氨酸的NES在高濃度的RanGTP中被CRM1識別，在核內形成NES.CRM1.RanGTP三聚體復合物，這個三聚體復合物在不需要GTP水解的情況下從NPC轉運到細胞質。然后，在RanGAP1和RanBP1/RanBP2的作用下GTP水解，使三聚體解聚。

2 RanBP1隨細胞周期的變化

哺乳動物RanBP1基因的表達受細胞周期各時期的條件控制。RanBP1基因轉錄在分化和休眠的細胞中效率低，但在分裂活躍的細胞中效率高。類視色素受體家族的因子對它起控制作用[4]。RanBP1蛋白水平隨細胞周期變化而變化，從S期到M期增加，有絲分裂中期達到高峰，分裂末期突然降低。在間期細胞中，RanBP1大部分位于細胞質中[5]。

與相同的組織學起源的未轉化細胞相比，轉化型細胞（Hela細胞）中的RanBP1mRNA和蛋白過表達。在一個周期正常的細胞中，RanBP1轉錄在中期調節物E2F和pRb的調控下，在G1/S點被激活[6]。進入S期后，在E2F/pRb直接控制下，發生高水平的RanBP1表達，同時，細胞周期進程中需要的許多其他基因也開始表達。這種類視色素受體和E2F/pRb通道的雙重控制表明，RanBP1在Ran網狀體系和有絲分裂裝置的之間起中樞調節作用。

3 RanBP1在紡錘體組裝中的作用

染色體分離依靠雙極紡錘體的活動，紡錘體由聚集的微管（MTs）組成。RanGTP和RCC1已被證明在MT形成中發揮積極作用，而過量的RanBP1，RanGAP1或者Ran突變體（T24N）抑制RCC1作用，進一步抑制MTs的形成和紡錘體組裝[7]。在無細胞的提取物中，這些影響明顯是不依賴于轉運的?；仡櫾谑箢惣毎薪獬绨滨}唑的抑制作用后所看到的結果，和在非洲爪蟾提取物的研究中所得出的作用機制是一致的。RanBP1水平升高，會擾亂在無細胞提取物中對MT形成起關鍵作用，依賴于RanGTP的相關作用，并且對噻氨酯噠唑去除后的MT生長和聚集的恢復有抑制作用。

有絲分裂在鼠類細胞的特征進一步表明，在整個細胞周期中，RanBP1過表達誘導多極紡錘體的產生。這些異常的紡錘體是由有絲分裂中心體內聚力喪失引起的。尤其，RanBP1過剩導致紡錘體極的中心粒分離，分開的中心粒能夠各自組裝有功能的微管排列，產生功能性的紡錘體極。依賴于RanBP1的中心粒分離在有絲分裂中被誘導產生，這要求微管完整和有活性的Eg5（調節中心粒分離的驅動蛋白）參與。證明RanBP1過表達對有絲分裂期間中心體的結構和動力學特點的關鍵因子會具有干擾作用[8]，多極和單極的現象在整個有絲分裂過程直到細胞分裂的末期都能看到，出現染色體在每個極的分配不均等，或者分離失敗[5]。

4 RanBP1對有絲分裂的調節

RanBP1是哺乳動物細胞Ran網狀體系的細胞周期調節因子，從G2期到細胞分裂后期保持高水平的狀態表明，相對于細胞周期的早期階段，在有絲分裂細胞中依賴于Ran的相互作用的調節要求RanBP1的濃集增強。事實上，RanBP1在哺乳動物細胞有絲分裂中明顯起作用，因為，它的過表達引起多極紡錘體的形成，并破壞有絲分裂的結束，但是，抗RanBP1的特異性抗體注射致使有絲分裂MTs抵抗噻氨酯噠唑（Nocodazole,NOC）誘導的解聚作用并產生染色體分配錯誤。因此，RanBP1對紡錘體形成和動力學有調節作用，而且，它和Ran的比率對于被調控過程的下游區是至關重要的[9]。

很多試驗表明，RanBP1在有絲分裂的細胞質中積聚。將抗RanBP1的抗體注入哺乳動物有絲分裂細胞中，觀察體內進行有絲分裂的過程，在前期或前中期紡錘體形成不受影響，而且染色體在赤道板上的排列正常，這和非洲爪蟾中的研究結果一致，可是接下來的有絲分裂過程的分裂后期被嚴重推遲，進一步出現姐妹染色單體分離失敗或不完全分離[5]。

最新研究表明，在RanBP1被耗盡的細胞中，發生前中期的細胞分裂延遲，或出現細胞凋亡。仍有活力的細胞裝配形態正常的紡錘體，但這些紡錘體過于穩定，不能對細胞周期調節蛋白B1（Cyclin-B1）進行補充，也不能對微管穩定因子HURP（DLG7）向微管正末端的定位進行限制。RanBP1缺失不增加獨立染色體出現的頻率，經常出現細胞分裂后期同源染色體的分離滯后。這些資料表明，RanBP1活性對調節微管功能特殊因子的正確定位是必須的，這種RanBP1活性的缺失增加以依賴于微管方式進行的非整倍性細胞增殖[9]。

RanBP1也有助于調整有絲分裂裝置的功能。RanBP1失活產生MTs過穩定，并在有絲分裂中導致編程性細胞死亡。綜合微管穩定藥物紫杉醇的作用，研究在轉化細胞自然發生的和紫杉酚誘導的凋亡過程中RanBP1的作用，研究表明，不考慮p53的水平，通過RNA干涉使RanBP1水平下調，使幾種轉化的細胞系發生編程性細胞死亡，但是在MCF-7乳腺癌細胞中，半胱天冬酶-3（細胞凋亡蛋白酶）缺失時這種反應不發生。和RanBP1水平正?；蜉^高的細胞比較，RanBP1干涉的細胞對紫杉酚處理產生的細胞凋亡反應增強，而這個反應是依賴于細胞凋亡蛋白酶的。這些結果表明RanBP1在靶向作用于MT的藥物治療中有調節作用[10]。

5 RanBP1在有絲分裂結束后核重組中的作用

有絲分裂開始和有絲分裂過程的進行依賴于細胞形態和組織結構的顯著變化，包括核膜破裂和染色體凝集。相反，有絲分裂后期的核重建要求染色體解聚，核膜重新組裝和通過核膜的轉運恢復。Ran在這些事件中起到重要作用，而RanBP1的負調節破壞它們的進行。

RanBP1在哺乳動物細胞中過表達，除了擾亂有絲分裂之外，也產生形態異常的核和染色體凝集改變的情況。這些核表達與MPM2抗體反應的有絲分裂磷酸化抗原決定基有關，而且通常排列成對，是異常的有絲分裂產物的代表。核異常情況包括均質的固縮染色質、有超濃縮斑點和邊緣不規則的核，以及不正常重組的核膜。核缺陷的細胞中突變型NES的過表達、輸出缺陷和RanBP1的產生更明顯。因此，異常高濃度的RanBP1持續存在，尤其是錯誤地定位于細胞核時會影響核的重建。這些結果表明，在細胞有絲分裂期到間期轉換時，Ran-BP1的水平下調對染色質濃縮和功能性間期核重組來說是必要的[11]。

在哺乳動物細胞中，在有絲分裂結束后Ran-BP1的消失可能是一個間期核形成開始的關鍵信號。正如上面所論述的，RanBP1轉染細胞在有絲分裂結束時RanBP1持續高水平表達，染色質去凝集失敗，也不能重組正常的核膜，這至少說明，RanGTP是活體內需要的，與過量的RanT24N的爪蟾體系中看到的有缺陷的重構核是一樣的。在RanBP1過表達的末期細胞中，沒有抑制Ran在細胞核中的重新定位，但出現了有絲分裂出口的不完善和間期核結構的重建失敗，進一步反映Ran的功能被抑制。

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