MLXIPL 、PMVK 、TRIB3基因啟動子區甲基化檢測方法的建立

錢 冉,鄭 芳,郭書忍,楊 娜

(1.武漢大學中南醫院基因診斷中心,湖北武漢 430071;2.咸寧學院實驗診斷學教研室)

MLXIPL 、PMVK 、TRIB3基因啟動子區甲基化檢測方法的建立

錢 冉1,2,鄭 芳1*,郭書忍1,楊 娜1

(1.武漢大學中南醫院基因診斷中心,湖北武漢 430071;2.咸寧學院實驗診斷學教研室)

目的 建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3啟動子區DNA甲基化檢測的方法。方法用亞硫酸氫鈉和對苯二酚處理外周血細胞基因組DNA標本,以修飾后的DNA標本為模板,每個基因分別用內外側兩套不同的引物對啟動子區進行巢式擴增。PCR產物進一步克隆、測序。結果測序結果表明,MLXIPL、PMVK、TRIB3啟動子區基因中的非甲基化的C堿基轉變為T堿基,而CpG島被甲基化的C堿基則不改變。結論成功地建立了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因甲基化檢測的方法,為探索基因啟動子區甲基化與疾病的關系做出了鋪墊。

甲基化;MLXIPL;PMVK;TRIB3;巢式聯合TD-PCR

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1166)

甲基化是真核細胞中DNA正常的修飾方式,但異常的甲基化常成為很多疾病發生的重要因素。目前在許多疾病中已經發現了DNA有不同程度的異常甲基化。已經確定的有動脈粥樣硬化(AS)病人中雌激素受體基因啟動子區高甲基化是導致AS的一個重要因素[1];惡性腫瘤病人腫瘤細胞基因組范圍出現DNA甲基化水平降低,且降低的程度與腫瘤的惡性度相一致。本實驗根據 MLXIPL、PMVK、TRIB3基因啟動子區CpG島的分布情況,聯合應用巢式、Touchdown PCR對其進行擴增并克隆測序,以明確基因的CpG島甲基化狀態。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象和標本 武漢大學中南醫院體檢中心正常人群。標本為外周血白細胞基因組DNA。

1.1.2 試劑 外周血基因組DNA提取試劑由自己配置,亞硫酸氫鈉和對苯二酚購自Sigma公司;DNA WinzardTMclearn-up system購自Promega公司;DNA純化試劑盒購自QIAGEN公司;TaqDNA聚合酶購自鉑優生物技術有限公司;PGM-T載體克隆試劑盒和Marker(50 bp ladder)購自北京天根生化科技有限公司;引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的制備 采2ml EDTA-Na2抗凝的靜脈血,用改良的NaI法及蛋白酶K法提取基因組DNA。再用QIAGEN公司試純化劑盒純化基因組DNA。然后在2%的瓊脂糖上電泳,并用紫外分光光度計檢測其濃度和純度,置-20℃冰箱保存備用。

1.2.2 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA ①DNA的重亞硫酸鹽處理:約2μg DNA用DDW 稀釋至50μl,加5.5μl新鮮配制3MNaOH,55℃孵育20min使基因組DNA充分變性。水浴期間配制10 mM對苯二酚(氫醌),亞硫酸氫鈉溶液即2.7 g亞硫酸氫鈉溶于4m l水并用10mMNaOH調pH值至5.0左右,定容至5 ml。加520μl的亞硫酸氫鈉溶液、30μl氫醌于水浴好的溶液中,再加入200μl石蠟油55℃水浴避光不超過16 h。②純化基因組DNA:使用PromegaWizard Clean up DNA純化回收系統(Promega,A 7280)按照說明書進行DNA純化回收。③去硫酸化和沉淀DNA:在純化好的樣本中加入4μl 3MNaOH,37℃放置15 min。再加22μl6M乙酸銨,4μl10 g/L糖原,250μl無水乙醇,置-20℃過夜沉淀④回收前一天過夜沉淀的DNA:4℃12 000 rpm離心15min,棄上清,收集沉淀,加入180μl 70%乙醇,4℃12 000 rpm離心5 min后棄上清并重復一次再加將殘存液體吸凈,室溫干燥10min后加入TE重懸,-20℃保存備用。

1.2.3 PCR ①根據UCSCGenome Browser Home(http://genome.ucsc.edu)中查到的啟動子區的序列,并針對3個基因的CG二核苷酸密集區設計引物,引物序列如表1。

表1 MLXIPL、PMVK、TRIB3引物序列和產物長度

②擴增啟動子片段:PCR擴增體系25μl,其中無菌去離子水15.5μl,10×反應緩沖液2.5μl,4×dNTP混合物2.5μl(2.5 mmol/L),正反向引物各1 μl(10 pmol),TaqDNA聚合酶 2.5U,DNA模板2μl。3個基因均采用一個擴增條件,如表2。

表2 PCR擴增條件

1.2.4 克隆及測序 將MLXIPL、PMVK、TRIB3的PCR產物和pGM-T載體連接,按照試劑盒說明書操作,將重組質粒轉入試劑盒感受態細胞,再接種到含氨芐青霉素的LB培養基平板上面并挑取單菌落,重組質粒經PCR鑒定后,送北京諾賽基因測序公司測序。

2 結果

2.1 PCR結果

以亞硫酸氫鈉和對苯二酚脫氨基處理后的外周血基因組DNA 為模板,對MLXIPL、PMVK、TRIB3啟動子區及第一外顯子區進行巢式擴增,先用外側引物擴增,2%瓊脂糖鑒定無目的條帶;再直接以外側產物2μl為模板,用內側引物25μl體系擴增,得到PCR產物。結果經2%瓊脂糖鑒定為目的序列。MLXIPL基因啟動子內側產物目的片段長度248 bp;TRIB3基因啟動子內側產物目的片段長度261 bp;PMVK基因啟動子內側產物目的片段長度246 bp。見圖1-3。

2.2 克隆測序結果

3種基因重組質粒測序結果表明,啟動子區CpG島中甲基化的C堿基在亞硫酸氫鹽處理后未發生改變。而未甲基化的C堿基經亞硫酸鹽處理后變為U堿基,再經PCR后在測序圖中表現為T堿基,即CG轉變為TG。

圖1 基亞硫酸氫鈉處理后MLXIPL因啟動子區CpG島的PCR產物

圖2 基亞硫酸氫鈉處理后PMVK因啟動子區CpG島的PCR產物

圖3 亞硫酸氫鈉處理后TRIB3基因啟動子區CpG島的PCR產物

3 討論

甲基化的檢測方法有很多,目前關于特異位點DNA甲基化的檢測應用得比較多的方法如下:①甲基化敏感性限制性內切酶(methylation-sensitive restriction endonuceasesMS-RE)-PCR/southern法②甲基化特異性的PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)③結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法(combined bisulphate restriction analysis,COBRA)④甲基化敏感性單鏈構象分析(methylation-specific single-strand conformation-analysis,MS-SSCA)[2]。這些方法都可以間接的反映某些CpG島的甲基化狀態,有的方法既價廉操作步驟又簡單,但是它們無法明確目的片段中每一個CpG位點的具體甲基化狀態,僅針對一個或者幾個CpG島。DNA甲基化是一個量變的過程,要研究MLXIPL、PMVK、TRIB3他們的啟動子區甲基化與疾病病的關系,靠以上方法提供的信息是遠遠不夠的。我們需要明確其啟動子區具體每一個CpG位點的特定甲基化狀態。而亞硫酸氫鈉法依賴的基因測序法恰能提供這些信息:標本經過過亞硫酸氫鈉處理后可將非甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶,后者經PCR反應擴增克隆變成胸腺嘧啶而產生T:A配對,但對甲基化的胞嘧啶亞硫酸氫鈉則沒有作用,DNA甲基化狀態不同的片段就可轉化為有堿基序列差異的2個片段,再通過克隆測序,不僅可以在測序過程中把目的序列全部CpG島給完整測出,還可以明確目的序列每一CpG島的甲基化狀態,這就為疾病與甲基化關系的研究提供了完整的信息。

在試驗過程中,亞硫酸氫鈉修飾過的基因組DNA存在著PCR擴增困難的問題。因為基因組DNA在修飾過程中,大部分的DNA己被降解成較小片段,回收后的DNA含有大量非全長目的DNA片段,純化過程中也伴隨DNA模板一定量的丟失[3]。而且因為堿基的變化即C變成U,使得序列的一致性增加導致引物設計困難,在設計過程中導致較多的引物錯配、二聚體及發夾結構。我們在引物設計過程中先避開基因序列中CG二核甘酸區域設計特異性的外側引物,即外側引物不含CG二核苷酸,先對模板進行外側引物的擴增,再針對外側產物設計內側引物,內側引物的長度應該在20-30 bp之間,產物長度應控制在300 bp以內[4]。擴增條件均采用TD-PCR法,使PCR反應對修飾后的模板要求降低,目的片段很容易擴出,大大提高了擴增的靈敏度和特異性,擴增效率大大提高。

基因的異常甲基化與許多疾病相關。目前關于基因MLXIPL、PMVK、TRIB3的DNA甲基化與疾病的關系的相關研究在國內外還未見報道。MLXIPL又稱為CHREBP(碳水化合物調節元件相關蛋白)是葡萄糖信號途徑中的轉錄因子,在糖和脂肪代謝中發揮重要的作用,它和SREBP-1c(固醇調節元件結合蛋白-1c)協同作用調節糖酵解和脂肪酸合成酶基因的表達[6]。PMVK基因編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMVK),他的cDNA長827 bp,在心臟的表達量是相當高的。他的主要作用是催化甲羥戊酸途徑的一個關鍵步驟,即從ATP中轉錄一個磷?；鶊F給5磷甲羥戊酸(M5P)生成5氯喹甲羥戊酸.這一步驟是哺乳動物中類異戊二烯和類固醇合成的唯一途徑,這條途徑在心血管等疾病的發病中有非常重要的意義[7]。TRIB3是哺乳動物tribbles的同系物,許多疾病的發生都與它的表達產生改變有關,如2型糖尿病的發生、某些炎癥反應性疾病、惡性腫瘤的發生。它通過阻滯磷酸蛋白激酶A的活性損害胰島素信號通路,使病人體內產生胰島素抵抗[8];它在離體的骨關節炎細胞中表達水平增加,這表明它與骨關節炎的發生有關[9];TRIB3編碼的蛋白質可使細胞對TNF和TRAIL誘導的細胞凋亡敏感。研究這些基因啟動子區甲基化狀態將為很多疾病的發病機制提供一個重要的解釋。

綜上所述,我們對MLXIPL、PMVK、TRIB3基因啟動子區甲基化的研究方法進行了一定程度的摸索,明確了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因的某些區域已發生了甲基化事件,下一步將對實驗方法進行一定的改進,擴大樣本量,探索此三個基因啟動子區甲基化與疾病發病的相關性。

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Detection method formethylation in p romoters ofM LXIPL、PMVK、TRIB3 Genes

QIAN Ran,ZHENGFang,GUOShu-ren,et al.(GeneDiagnosiscenter,Zhongnan Hosipta lofWuhan430071,China)

ObjectiveTo establish time-efficient and sensitive method for detection of the methylation in MLXIPL、PMVK、TRIB3 genes promoter.M ethods The two sets of primerswere used to amplify each target DNA fragments by nest PCR combined touch-down PCR.The PCR productswere further cloned and sequenced.Resu lts The sequencing results showed that unmethylated cytosine residues(C)were transformed to uracil(U),whilemethylated cytosine(mC)remained unchanged.ConclusionIn the present study,methods for the detection ofmethylation states ofMLXIPL,PMVK,TRIB3 genes promoterswere successfully established,which provide a technique for exploring the relation between disease and themethylation of thesegenes.

methylation;MLXIPL;PMVK;TRIB3;nest PCR combined touch-down PCR

Q78

A

1007-4287(2010)08-1166-04

*通訊作者

2009-08-19)