非小細胞肺癌患者中Survivin抗體的臨床意義及診斷價值

馬麗 岳文濤 張麗娜 王玥 張春彥 楊學惠

Survivin作為凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins, IAP）家族的重要成員，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用。Survivin幾乎表達于所有的惡性腫瘤，但在人體正常終末分化的組織細胞中不表達或低表達。腫瘤自身抗體產生的機制雖然還不明確，但是同腫瘤相關抗原一樣，其與腫瘤的發生發展存在密切的聯系。據研究顯示在多種癌癥血清中可以檢測到Survivin自身抗體的存在，如頭頸癌、卵巢癌[1]以及消化系統腫瘤胃癌[2]、結腸直腸癌[3]、肝癌[4]等。在肺癌患者血清中同樣可以檢測到Survivin自身抗體[3,5]，但Survivin自身抗體能否成為具有肺癌診斷價值的腫瘤標志物以及與肺癌病理參數是否存在相關性，目前尚不統一。本研究旨在以Survivin融合蛋白原核表達為基礎，建立肺癌患者血清中Survivin自身抗體的間接ELISA方法，探討Survivin自身抗體在215例非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者中可能存在的臨床意義及診斷價值。

1 材料與方法

1.1 細胞系及菌株 肺癌細胞系A549、E.coil菌株BL21(DE3)以及pET30a(+)載體為北京市結核病胸部腫瘤研究所細胞生物學實驗室凍存。

1.2 材料 pGEM-Teasy、T4 DNA連接酶、高保真酶PCR試劑盒購自NEB公司；限制性內切酶NdeI和XhoI購自寶拓科技發展有限公司；逆轉錄酶、Oligo(dT)15 Primer購自Promega公司；鎳離子親和層析柱購自威格拉斯生物技術（北京）有限公司；Survivn單克隆抗體購自優寧維公司；PCR引物合成及DNA測序由上海生工北京分公司生物技術有限公司完成。

1.3 研究對象 本研究使用的血清標本于2008年3月-2009年12月由北京市結核病胸部腫瘤研究所標本庫收集并提供。89例健康志愿者，20例肺部良性疾病，包括10例肺結核、6例肺炎、2例支氣管擴張癥、2例錯構瘤；215例NSCLC患者，男性147例，女性68例，平均年齡59.25歲，其中＜60歲106例，≥60歲109例，年齡最大84歲，最小30歲。鱗癌83例，腺癌132例，臨床分期：依據1997年國際抗癌聯盟（UICC）TNM分期標準，其中I期-II期44例，III期-IV期161例。全組血清收集標準：健康對照組均身體健康，體檢無異常表現，臨床各項生化指標正常；肺癌患者血清標本以及肺部良性疾病患者血清標本均采集自首次到北京市胸科醫院就診，未經任何化療和治療，且腫瘤類型均經組織病理學證實，標本分裝后于-80oC凍存。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR 取5×106對數生長期肺腺癌細胞系A549細胞，Trizol一步法提取總RNA，使用Access RT-PCR System（Promega A1280）反轉錄試劑盒，按照說明書操作獲得cDNA。

根據Survivin基因組序列用primer premier 5軟件設計引物，在正、負鏈的5’端分別引入NdeI和XhoI酶切位點，正義鏈：5’-TTAACTCGCGATCCATGGCAGCCAGC-3’，反義鏈：5’-AATACATATGATGGGTGCCCCGACG-3’）。取cDNA模板2 μL、2 U/μL高保真DNA聚合酶1 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、10 mmol/L上、下游引物各1 μL、10×PCR buffer 5 μL，補水至50 μL。熱啟動95oC、5 min，循環參數為94oC、30 s，56oC、45 s，72oC、1 min，共30個循環，72oC延伸10 min，4oC終止反應。

1.3.2 表達載體pET30a(+)/Survivin的構建和鑒定 PCR產物克隆入載體pGEM-Teasy中，轉化感受態細胞E.coli DH5α，藍白斑篩選，限制性內切酶NdeI/XhoI雙酶切初步鑒定重組質粒，挑選陽性克隆菌株，擴增并提取pGEM-Teasy/Survivin質粒。NdeI/XhoI雙酶切pGEM-Teasy/Survivin和pET30a(+)，65oC、20 min酶滅活，切膠回收酶切片段。pET30a(+) 1 μL、pGEM-Teasy/Survivin 3 μL、T4連接酶1 μL、2×T4連接buffer 5 μL，4oC連接過夜，構建表達載體pET30a(+)/Survivin，并轉化感受態細胞E.coli DH5α，挑取克隆菌株，擴增提取質粒，PCR及雙酶切鑒定的陽性克隆菌株送往上海生物技術有限公司北京分公司進行測序，將測序結果正確的pET30a(+)/Survivin轉化入E.coli BL21(DE3)中，用含45 μg/mL卡那青霉素LB固體培養基37oC過夜培養。

1.3.3 pET30a(+)/Survivin在E.coli BL21(DE3)中的誘導表達 挑取pET30a(+)/Survivin/E.coli BL21(DE3)克隆菌斑，37oC、250 rpm過夜振蕩培養，按照1:100比例接種于LB-kan+液體培養液（含30 μg/mL卡那青霉素的LB），37oC、250 rpm培養至OD600約0.6-0.8時，以終濃度為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.8 mmol/L、1 mmol/L IPTG誘導菌液3 h，分別取1 mL菌液，12 000 rpm離心1 min收集菌體，取50 μL 2×loading buffer與菌體充分混勻、100oC水浴5 min，離心后取10 μL上清用于12% SDS-PAGE電泳分析，篩選最適IPTG誘導濃度，同時設空載體pET30a(+)以及未誘導pET30a(+)/Survivin作為陰性對照。

1.3.4 Survivin融合蛋白的Western blot鑒定 取最適IPTG誘導菌液樣本10 μL，經12% SDS-PAGE電泳分離后，電轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉4oC封閉過夜，分別用1:500抗His抗體、1:1 000 Survivin單克隆抗體37oC孵育2 h，PBST洗滌3次×10 min，1:10 000羊抗小鼠抗體-HRP 37oC孵育1 h，PBST洗滌3次×10 min，ECL顯色，Western blot分析。

1.3.5 包涵體的制備及蛋白純化 利用細胞分層分級技術，確定Survivin融合蛋白的表達形式。500 mL細菌培養液在最適IPTG濃度下誘導培養，收集菌體，冰浴超聲破碎，7 000 rpm、4oC離心20 min，收集沉淀，溶解于含15 mL 6 mol/L鹽酸呱、10 mmol/L Tris·Cl（pH7.0）、10 mmol/L DTT的變性液中，4oC過夜。次日7 000 rpm、4oC離心20 min，收集上清，0.45 μm濾膜過濾，4oC下以0.5 mL/min速度加入鎳離子親和層析柱中，而后分別用20 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L咪唑溶液洗脫目的蛋白。收集各洗脫峰流出液，分別取10 μL樣本100oC水浴5 min，經12% SDS-PAGE電泳確定并回收含有Survivin融合蛋白的洗脫液，4oC下PBS（pH7.4）透析3 h，冷凍干燥所得的蛋白干粉于-20oC保存。

1.3.6 間接ELISA方法的建立和血清樣本的檢測 Survivin蛋白（純度＞95%）以15 μg/mL溶于0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）中，100 μL/孔，4oC靜置過夜；棄去板孔內液體，200 μL PBST洗板3次；100 μL 5%脫脂奶粉37oC封閉1 h；腫瘤患者血清1 μL/孔，37oC孵育2 h；200 μL PBST洗板3次；100 μL 1:10 000稀釋的羊抗人IgG-HRP， 37oC孵育1 h；200 μL PBST洗板4次；100 μL TMB顯色液，37oC避光顯色5 min；100 μL終止液終止顯色反應，自動酶標儀上讀取450 nm處OD值。PBS作為陰性對照孔，1:400 Survivin單克隆抗體作為陽性控制孔，10份健康人血清標本作為陰性控制孔，幫助評價不同孔板間的差異以減少板間誤差，空白孔調零。

1.3.7 數據處理 本實驗中血清樣品OD值均取復孔均值；采用SPSS 13.0軟件進行數據整理和統計分析，χ2檢驗用于計數資料統計分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR的結果 Survivin基因RT-PCR擴增產物及陰性對照（PBS作為模板）分別取5 μL樣本，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖1示：在250 bp-500 bp DNA marker（上海生工DL2000）之間顯示的DNA條帶與人Survivin基因的cDNA 429 bp相符合，陰性對照無條帶出現。

2.2 重組質粒的鑒定 重組質粒pGEMT-Teasy/Survivin雙酶切后得到500 bp左右大小的片段，亞克隆至pET30a(+)中， NdeI及NdeI和XhoI酶切pET30a(+)/Survivin重組質粒，10 μL酶切產物樣本經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析結果如圖2示，單酶切產物與線型pET30a(+)/Survivin質粒的位置大小一致，雙酶切產物在400 bp-500 bp之間有一條明顯片段。酶切產物測序結果經BLAST比對，與GenBank上所報道的人Survivin基因相一致，pET30a(+)/Survivin表達載體構建成功。

2.3 Survivin蛋白的表達及鑒定 菌液經不同濃度IPTG誘導，收集并制備樣本，點樣于12%SDS-PAGE電泳，分析結果如圖3示，在約19 kDa處出現一新蛋白條帶，其含量約占菌體總蛋白的50%，而空載體轉化的菌株無相應蛋白條帶出現，說明新生蛋白條帶非空載體pET30a(+)重組到E.coil BL21(DE3)所表達的蛋白；pET30a(+)/Survivin未誘導菌株同樣無相應蛋白條帶出現，說明在無IPTG誘導情況下，重組至E.coil BL21(DE3)中的Survivin基因是不能在E.coil BL21(DE3)中表達；而在IPTG誘導下，重組至E.coil BL21(DE3)中的Survivin基因可成功表達Survivin蛋白；由于誘導蛋白表達的IPTG濃度的不同，導致Survivin蛋白表達量不同，以0.4 mmol/L IPTG濃度誘導E.coil BL21(DE3)時，Survivin蛋白表達量最高，為最優蛋白表達條件。Western blot分析結果如圖4示：抗His標簽抗體和抗Survivin單克隆抗體孵育的新生蛋白條帶處，均可見與Survivin蛋白分子量大小相一致的特異性抗原、抗體反應條帶，進一步證實新生條帶為Survivin蛋白。

圖 1 Survivin基因PCR擴增的結果。M：DNA marker；1：Survivin RT-PCR產物；2：陰性對照。Fig 1 PCR amplification of Survivin. M: DNA marker; 1: RT-PCR product of Survivin; 2: Negtive control.

圖 2 重組質粒的酶切鑒定。M：DNA marker；1：pET30a(+)/Survivin質粒；2：單酶切產物；3：雙酶切產物。Fig 2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid. M: DNA Marker; 1: pET30a(+)/Survivin plasmid; 2: Single restriction enzyme digestion; 3: Double restriction enzyme digestion.

圖 3 不同濃度IPTG誘導的Survivin的表達。M：Protein marker；1：空載體pET30a(+)；2：0 mmol/L IPTG；3：0.1 mmol/L IPTG；4：0.2 mmol/L IPTG；5：0.3 mmol/L IPTG；6：0.4 mmol/L IPTG；7：0.8 mmol/L IPTG；8：1 mmol/L IPTG。Fig 3 The expressions of pET30a(+) and pET30a(+)/Survivin induced at different IPTG concentraions. M: Protein marker; 1: pET30a(+); 2: 0 mmol/L IPTG; 3: 0.1 mmol/L IPTG; 4: 0.2 mmol/L IPTG; 5: 0.3 mmol/L IPTG; 6: 0.4 mmol/L IPTG; 7: 0.8 mmol/L IPTG; 8: 1 mmol/L IPTG.

圖 4 Survivin蛋白的Western blot的鑒定。M：Protein marker；1：抗his單克隆抗體孵育；2：抗survivin單克隆抗體孵育。Fig 4 The Western blot result of Survivin. M: Protein marker; 1: Anti-his monoantibody; 2: Anti-Survivin monoantibody.

圖 5 Survivin蛋白的純化。M：Protein marker；1：超聲后上清；2：溶解的包涵體；3：20 mmol/L咪唑洗脫液；4：30 mmol/L洗脫液；5：50 mmol/L咪唑洗脫液；6：純化的Survivin蛋白。Fig 5 Purification of Survivin protein. M: Protein marker; 1: Supersonical supernatant; 2: Solved inclusion; 3: 20 mmol/L iminazole eluention; 4:30 mmol/L iminazole eluention; 5: 50 mmol/L iminazole eluention; 6:The purificationof Survivin protein.

2.4 Survivin融合蛋白的純化 利用細胞分層分級技術確定Survivin蛋白在E.coil BL21(DE3)中是以包涵體形式大量表達。Survivin融合蛋白的C端含有6×his標簽，采用鎳離子親和層析方法純化蛋白，利用不同濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白，并將超聲后的上清液及不同濃度的咪唑洗脫液收集行12% SDS-PAGE電泳如圖5示，菌體冰浴超聲后上清中未見Survivin蛋白條帶，說明Survivin蛋白未表達在細菌的周質腔中；而在含有20 mmol/L、30 mmol/L、50 mmol/L咪唑的洗滌液中可見大量的雜蛋白，說明低濃度咪唑起到了去除雜蛋白的作用；而當洗脫液中的咪唑濃度為100 mmol/L時，可將Survivin蛋白洗脫下來，經透析、濃縮獲得純度在95%以上Survivin蛋白。

2.5 NSCLC患者血清中Survivin自身抗體的檢測及臨床意義 利用間接ELISA方法檢測血清中Survivin自身抗體的含量，其中89例健康志愿者的A450最高值為0.683，最低值為0.162，平均值為0.427，標準差為0.115。以Mean+2SD作為陽性血清樣品的評判標準，A450≥0.657即可判為Survivin自身抗體陽性；反之，則判為陰性。Survivin在215例NSCLC患者血清的陽性率為19.5%，特異性為88.9%。而在20例肺部良性疾病患者血清中Survivin抗體檢測均為陰性，由于良性疾病的標本例數太少，統計學分析結果不能充分代表肺部良性疾病患者情況，只能以此作為參考。

Survivin自身抗體與NSCLC患者病理參數之間是否存在統計學意義上的相關性，目前還存在著爭議，本實驗認為Survivin自身抗體在NSCLC患者血清中的含量與肺部原發腫瘤的大小存在著明顯的統計學意義上的相關性（P＜0.05），即NSCLC患者血清中Survivin自身抗體檢測為陽性時，肺部原發腫瘤體積≥3 cm的可能性越大。Survivin自身抗體在NSCLC患者中血清中的含量與肺部腫瘤存在遠處轉移也具有統計學意義上的相關性（P＜0.05），即NSCLC患者血清中Survivin自身抗體檢測為陽性時，NSCLC患者的腫瘤易發生遠處轉移。而Survivin自身抗體在NSCLC患者中血清中的含量與NSCLC患者的年齡、性別、是否吸煙、病理類型、淋巴結轉移以及臨床分期均無相關性，具體數據見表1。

2.6 腫瘤標志物的聯合檢測 本實驗通過對215例NSCLC患者病歷資料的整理及Survivin自身抗體在NSCLC患者血清中表達情況進行統計分析發現，CEA與Survivin自身抗體聯合檢測的陽性率為42.79%，明顯高于癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）與神經元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase, NSE）、鱗狀細胞癌抗原（squamous cell carcinoma, SCC）、細胞角蛋白（cytokeratin,CYFせ）、胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin releasing peptide,ProGRP）的聯合檢測的陽性率，具體數據見表2。

表 1 臨床病理參數與Survivin自身抗體表達之間的關系Tab 1 The relationship between clinicopathological parameters and the expression of anti-Survivin antibody in NSCLC

表 2 幾種腫瘤標志物在NSCLC患者中的聯合檢測的結果Tab 2 The combined detection result of tumor markers in NSCLC

3 討論

Survivin是凋亡抑制蛋白家族中的最強的凋亡抑制因子。人Survivin基因定位于17q25，全長1 447 kb，含有4個外顯子和3個內含子，編碼142個氨基酸，蛋白相對分子質量約16.5 kDa。Survivin蛋白幾乎表達于所有惡性腫瘤，而在成人終末分化組織不表達或低表達。腫瘤相關的自身抗體同腫瘤相關抗原一樣與腫瘤的發生、發展存在著密切聯系。目前研究顯示在許多種癌癥中均可以檢測到Survivin自身抗體的存在。為了探索Survivin自身抗體在NSCLC患者中可能存在臨床診斷價值，本實驗成功構建了原核表達載體pET30a(+)/Survivin，誘導表達、純化純度在95%以上的Survivin融合蛋白，并建立間接ELISA方法對215例NSCLC患者、89例健康對照以及20例肺部良性疾病患者進行Survivin自身抗體的血清學檢測，結果顯示Survivin自身抗體在NSCLC患者血清中檢測的陽性率為19.5%，特異性為88.9%，與目前的研究結果相類似。Yagihashi等[6]利用間接ELISA方法檢測31例NSCLC患者血清中Survivin自身抗體，其陽性率為58.1%；在Rohayem等[7]研究顯示51例肺癌患者的血清中Survivin自身抗體的陽性率為21.6%；而Karanikas等[8]研究結果顯示Survivin自身抗體在76例NSCLC患者血清中的陽性率為7.7%。幾個實驗組所得的Survivin自身抗體的陽性率均與本實驗的Survivin自身抗體在肺癌患者血清中檢測的陽性率不一致，分析其原因可能是由于樣本來源、樣本大小以及使用的評判標準不同，在實驗結果上可能存在著一些差異，但在肺癌的研究中Survivin自身抗體仍是個比較有意義的腫瘤標志物。到目前為止，Survivin自身抗體在NSCLC患者血清中表達量至今仍未能得到一個公認的陽性定量標準，還需大量實驗進一步研究。

Survivin自身抗體與癌癥患者病理參數之間是否存在統計學意義上的相關性，目前還存在著爭議，Karanikas等[8]研究結果顯示，Survivin自身抗體與NSCLC患者的病理參數之間的相關性無統計學意義上，僅能作為一個預后及藥效評價的參考指標。而本實驗認為NSCLC患者血清中Survivin自身抗體檢測為陽性時，肺部原發腫瘤體積≥3 cm的可能性越大，NSCLC患者的腫瘤更易發生遠處轉移。腫瘤的轉移與原發腫瘤的大小的聯系緊密，原發腫瘤體積越大，腫瘤易發生轉移。但是本實驗經相關分析得出原發腫瘤大小與遠處轉移未存在明顯相關性（r=0.167, P＞0.05），因此本實驗認為NSCLC患者血清中的Survivin自身抗體為陽性時，NSCLC患者的腫瘤更易發生遠處轉移。這一結論為今后Survivin自身抗體能否成為術前評估、腫瘤惡化程度及腫瘤遠處轉移的參考指標提供了潛在的研究價值。

20例肺部良性疾病患者血清中Survivin抗體檢測均為陰性，由于肺部良性疾病的標本例數太少，不能充分說明Survivin自身抗體特異性較高這一優勢，還需大量實驗進一步證實。

Survivin自身抗體在215例NSCLC中的陽性檢出率不是很高，為提高腫瘤的檢測的敏感性，腫瘤標志物的聯合檢測成為腫瘤臨床檢測的趨勢。目前以CEA、NSE、SCC、CYFRA、ProGRP的聯合應用最為廣泛，但是這種組合并非是針對NSCLC的臨床檢測所設計，敏感性不是很高。為了提高診斷的質量、尋找特異性和敏感性較高的腫瘤標志物，腫瘤標志物的不同組合的聯合檢測成為新的研究熱點。本實驗通過對215例NSCLC患者病歷資料的整理及Survivin自身抗體在NSCLC患者血清中表達情況進行統計分析發現，CEA與Survivin自身抗體聯合檢測的陽性率為42.79%，明顯高于CEA與NSE、SCC、CYFRA、ProGRP的聯合檢測的陽性率，大大提高了腫瘤標志物在NSCLC檢測的敏感性，為Survivin自身抗體可能應用于肺癌的臨床檢測提供了廣闊的應用前景。

總之，Survivin自身抗體作為NSCLC診斷的新亮點，其潛在價值越來越引起腫瘤研究者的廣泛關注。Survivin自身抗體與其它腫瘤標志物的聯合檢測在腫瘤臨床診斷上具有廣闊的研究前景，尤其是對于高危人群的篩選和腫瘤的早期診斷上，Survivin自身抗體潛在的應用價值還需不斷的探索。