血紅蛋白固定在Ti0.865O2納米片層間的直接電化學和電催化

吳益華（上海第二工業大學城市建設與環境工程學院，上海 201209）

血紅蛋白固定在Ti0.865O2納米片層間的直接電化學和電催化

吳益華
（上海第二工業大學城市建設與環境工程學院，上海 201209）

通過對層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀進行剝離，可以制備得到Ti0.865O2納米片溶膠。將Ti0.865O2納米片作為載體固定血紅蛋白（Hb），制備得到Hb/Ti0.865O2/納米片修飾的熱解石墨（PG）電極。在Ti0.865O2納米片層間，Hb能實現與電極的直接電子轉移。在pH值為5.6的磷酸鹽緩沖溶液中，該修飾電極的循環伏安曲線上顯示出一對可逆的氧化還原峰，式電位為－230 mV (vs.Ag/AgCl)。該修飾電極對H2O2有良好的電催化響應，線性響應范圍為50 μM到2.2 mM，靈敏度為10 uA·mM-1·cm-2。

血紅蛋白；雙氧水；直接電化學；電催化

0 前言

生物傳感器是一種以生物活性物質（如酶、抗體、核酸、細胞等）為敏感基元，通過將其固定在信號轉換器上構成生物轉化器，把生物化學信號轉換為相應的物理化學信號的儀器[1]。生物傳感器具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低等特點，在生物、醫學、環境監測、食品、醫藥與軍事醫學領域有著重要的應用價值，已引起世界各國極大的關注[2－5]。遺憾的是，在生物傳感器中，蛋白質在電極表面通常易被吸附，可能造成構像變化和喪失活性，從而使得蛋白質在電極表面的電子傳遞能力受到抑制。因此，要實現這些缺乏長程電子通道蛋白質的直接電子轉移，需要采取一些特定的方法來達到如下目的：1）蛋白質的活性中心盡可能地接近電極表面；2）使蛋白質分子適當變形但不失活；3）使電極表面與蛋白質分子充分接觸；4）通過修飾電極打開電子通道。一個比較有效的方法就是用適當的材料固定蛋白質于電極上，從而促進蛋白質與電極的直接電子傳遞[6－8]。

很多材料，如聚合物膜[9]、納米材料[10－11]、表面活性劑[12－13]、類脂膜[14]等都被用于固定蛋白質以制造生物傳感器。納米結構的氧化鈦材料也被廣泛用于固定蛋白質制造生物傳感器。氧化鈦納米材料具有高比表面積、強吸附能力、良好的生物相容性以及優異的熱和化學穩定性等一系列優良特性。許多課題組都報道了利用各種納米結構氧化鈦材料作為主體負載蛋白質制造生物傳感器的方法。這些納米結構包括氧化鈦納米顆粒、氧化鈦納米管、介孔氧化鈦、氧化鈦鈉米片等[15－19]。

我們通過對層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀進行剝離，制備得到了Ti0.865O2納米片溶膠，并且用此Ti0.865O2納米片固定血紅蛋白，實現了血紅蛋白有效地直接電子轉移，同時考察了血紅蛋白修飾電極（記為Hb/ Ti0.865O2/PG）對H2O2的電催化行為。

1 試驗方法

1.1 試劑

采用分析純氧化鈦，碳酸鋰，碳酸鉀，濃鹽酸，四正丁基氫氧化銨（TBAOH，40 wt %水溶液）。其余試劑和材料還有血紅蛋白（Hb, 分子量68 000，等電點pI為6.8，上海華美生物試劑公司）0.1 mol·L-1，pH值為5.6的磷酸緩沖溶液(PBS用Na2HPO4與NaH2PO4溶液按一定比例配制)，去離子試驗用水，熱解石墨電極，鉑絲導線，銀漿。

1.2 血紅蛋白的固定

將按文獻[20]制備得到層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀（化學式K0.8Ti1.73Li0.27O4）的粉體質子化，得到固體鈦酸（H1.07Ti1.73O4·H2O），其步驟如下：將鈦酸鋰鉀與1.0 M 鹽酸以1 g/100 mL的固液比進行質子交換反應，并室溫攪拌一天。為了使質子化充分，需要重復上述步驟三次，然后離心、水洗、室溫風干。將此固體鈦酸分散在四正丁基氫氧化銨水溶液中，攪拌大約7天，得到懸浮液，然后在8 000 r/min下離心分離，得到上層氧化鈦（Ti0.865O2）納米片溶膠[21]。調整pH值致8左右；調整濃度為1 mg/ mL，備用。此納米片溶膠和3.8 mg/mL的血紅蛋白溶液等體積混合，再逐滴加入1.0 M稀醋酸。當體系pH值在5.7左右時，引發沉淀生成。在pH值為5.7左右時，血紅蛋白帶正電荷，并與帶正電荷的Ti0.865O2納米片通過靜電力組裝在一起。

1.3 電極的制備

將熱解石墨(PG)電極分別用粗砂紙打磨，并用氧化鋁粉拋光，然后分別在丙酮和去離子水中超聲清洗5分鐘，最后用銀漿將電極和鉑絲導線相連。將固定化酶懸浮液滴涂在電極表面，在空氣中干燥，即得實驗用血紅蛋白修飾電極Hb/ Ti0.865O2/PG。電極不用時，在4 ℃空氣中保存。

1.4 測試儀器及方法

在日本理學Rigaku D/Max-rB型X射線衍射儀上進行X射線衍射測試。小角度X射線衍射測試條件為：掃描速度為0.6o/min；掃描步長為0.002o。

在CHI440電化學工作站上進行循環伏安和時間電流測試。 所有的電化學測試都是在室溫下（22℃±2℃）的三電極電解池中進行。熱解石墨為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl為參比電極。在檢測雙氧水的過程中，向工作電極加－0.4 V（vs. Ag/AgCl）的電壓，直至得到穩態電流，然后向池中加入一定量的雙氧水，并記錄電流隨時間的變化。在所有的電化學測試前，都要用高純氮氣向溶液鼓泡30分鐘來除氧。所有的測試也都是在氮氣保護環境中進行的，以排除氧氣的干擾。

2 結果與討論

2.1 結構分析

圖1是試驗中合成的層狀纖鐵礦型鈦酸鋰鉀K0.8Ti1.73Li0.27O4和質子化的H1.07Ti1.73O4·H2O的粉末X射線衍射圖。所得結果與以前文獻[20,22]報道的晶胞參數相同，并已經對衍射結果進行了指標化。

圖1 (a) H1.07Ti1.73O4·H2O, (b) K0.8Ti1.73Li0.27O4的粉末X射線衍射圖Fig. 1 Powder X-ray diffraction patterns for (a) H1.07Ti1.73O4·H2O, (b) K0.8Ti1.73Li0.27O4

圖2 顯示的是固定化酶的小角X射線衍射圖。低角度出現的比較強的衍射峰，說明了血紅蛋白固定在氧化鈦無機層的中間。XRD分析表明，對于此種樣品，層間距為7.0 nm，減去氧化鈦單層厚度0.75 nm，為6.25 nm，略小于蛋白質分子(5.3 nm × 5.4 nm× 6.5 nm)最大軸6.5 nm，因此蛋白質在層間屬于單層規則排列。

圖2 Hb/Ti0.865O2修飾電極的衍射圖譜Fig. 2 XRD pattern of Hb/Ti0.865O2modified electrode

2.2 血紅蛋白的直接電化學

圖3顯示的是在濃度為0.1 M，pH值為5.6的磷酸緩沖溶液中Hb/Ti0.865O2熱解石墨修飾電極（a）和氧化鈦納米片石墨修飾電極（b）的循環伏安曲線，掃描速度是100 mV· s-1。Hb/Ti0.865O2熱解石墨修飾電極有一對形狀相似、大小相當的氧化還原峰，分別在－281 mV和－179 mV，說明存在著可逆的電子轉移。在掃描電壓范圍內，氧化鈦修飾電極沒有電化學響應，是非電活性的，因而可以判斷這對氧化還原峰是來源于血紅蛋白分子的氧化還原。

圖3在濃度為0.1M， pH為5.6的磷酸緩沖溶液中Hb/Ti0.865O2熱解石墨修飾電極a和氧化鈦納米片石墨修飾電極b的循環伏安曲線（掃描速度是100 mV· s-1）Fig. 3 CVs of a titania nanosheets modified electrode, b Hb modified electrode in 0.1M, pH 5.6 PBS at a scan rate of 100 mV· s-1

圖4 顯示的是在不同掃描速率下，Hb/Ti0.865O2修飾電極的循環伏安曲線。隨著掃描速率的增加，峰電流也不斷增加，而且呈線形關系，說明這個電極反應是一個表面控制的準可逆過程。

2.3 溶液pH值對電極的影響

固定的血紅蛋白的電化學性質和溶液的pH值密切相關。圖5顯示的是式電位和pH值之間的關系。當pH值在3.3到11之間時，式電位和pH值呈線性關系，斜率是－47mV·pH-1。理論預測含血紅素蛋白在發生可逆電子轉移時伴隨著質子的轉移過程，式電位對pH值呈線性關系，在室溫時斜率的理論值為－59mV·pH-1。雖然實驗值比理論值稍小，但是在誤差范圍以內。當pH值大于11或者小于3.3時，式電位對pH值明顯偏離原來的直線關系，說明蛋白質發生了某種變性，導致了前面的一電子一質子機制的失效。

圖4 Hb/Ti0.865O2修飾電極在0.1 M， pH值為5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中的循環伏安曲線（掃描速度分別為100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900和1000 mV·s-1；插圖表示氧化和還原峰電流對掃描速度的線性關系）Fig. 4 CVs of Hb modified electrode in 0.1M pH 5.6 PBS at a scan rate of 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 and 1000 mV s-1. Inset: Plot of peak current vs. scan rate

圖5 Hb/Ti0.865O2修飾電極式電位對pH值的線性關系Fig. 5 The linear plot of the formal potentials obtained from CV at a scan rate of 200 mV· s-1for the Hb modified electrode vs. pH

2.4 血紅蛋白對雙氧水的電催化行為

圖6描述了恒定電位為－400 mV (vs. Ag/AgCl)時，Hb/Ti0.865O2修飾電極對雙氧水濃度變化的時間-電流響應曲線，每次加入雙氧水的濃度為50 μM。由圖6可見，催化峰電流隨H2O2濃度的增大而增大，在一定范圍內呈線性關系： ipc= 21.65 + 0.01 c (H2O2)，相關系數r = 0. 999。由此可知，修飾電極的檢測線性范圍為50 μM到2.2 mM，檢測限為20 μM，對應的靈敏度為10 uA·mM-1·cm-2。

圖6 在0.1 M， pH值為5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，－400mV的電壓下Hb/Ti0.865O2修飾電極對雙氧水的電流響應曲線（每次加入雙氧水的濃度為50μM）Fig. 6 Amperometric response of Hb/Ti0.865O2modified electrode at -400 mV upon successive addition of 50 μM H2O2to 0.1M, pH 5.6 PBS buffer solution (pH 5.6)

3 結論

用剝離-重組的方法制備了Hb/Ti0.865O2修飾的熱解石墨電極。Hb在此修飾電極上能進行直接電子傳遞。用循環伏安法研究了Hb的電化學行為。該電極對H2O2表現出良好的電催化性能，催化峰電流在一定范圍內與H2O2濃度呈線性關系，可作為生物傳感器檢測H2O2。

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Direct Electrochemistry and Electrocatalysis of Hemoglobin Entrapped in the Galleries of Ti0.865O2Nanosheets

WU Yi-hua
(School of Urban Development and Environmental Engineering, Shanghai Second Polytechnic University, Shanghai, 201209, P.R. China)

Hb/Ti0.865O2nanosheets were prepared by exfoliated from the layered lepidocrocite-related potassium lithium titanate. Hemoglobin (Hb) was entrapp in the galleries of Ti0.865O2nanosheets. The CV (cyclic voltametry) results of the Hb/Ti0.865O2modified pyrolytic graphite electrode showed a pair of well-defined, quasi reversible redox peaks centered at -230 mV (vs. Ag/AgCl) in pH 5.6 phosphate buffer solution. The modified electrode exhibited good electrocatalytic response for monitoring H2O2and have a large linear detection range from 50 μM to 2.2 mM and a sensitivity of 10 μA mM-1cm-2.

hemoglobin; hydrogen peroxide; direct electrochemistry; electrocatalysis

O614.41

A

1001-4543(2010)01-0001-06

2009-09-25;

2009-12-24

吳益華（1981－），男，江蘇無錫人，博士，主要研究方向為復合材料，電子郵件：yhwu@eed.sspu.cn。

上海高校選拔培養優秀青年教師科研專項基金（No.egd08011）