西妥昔單抗對非小細胞肺癌細胞的體外抑制作用

陳真 陳智偉

肺癌分子靶向治療常用的治療靶點有：細胞受體、信號傳導和抗血管生成等，其中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是目前最為主要的靶點。目前已被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準用于臨床治療的EGFR家族特異性靶向藥物主要分為兩大類：一類是小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI），如吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）；另一類是人源化單克隆抗體，如EGFR特異性抗體西妥昔單抗（cetuxmab）和HER2特異性抗體赫賽?。╰rastuzumab）。針對EGFR進行抗腫瘤治療的單克隆抗體可阻斷配體與EGFR的結合。這些抗體能夠識別受體的胞外結構域，競爭與配體的結合位點，抑制EGFR的二聚化并下調細胞表面EGFR的數量[1]。有研究者[2]認為EGFRTKI的療效受到腫瘤組織EGFR基因突變的影響，沒有發生突變的患者可能表現為無效；而EGFR基因突變并不影響EGFR單抗的療效，因此受到人們的關注。

已有相關文獻報道了西妥昔單抗應用于肺癌治療的臨床研究，其中不乏III期臨床研究證據。本研究的目的在于探討運用西妥昔單抗對人肺癌細胞和增殖的體外抑制作用，對EGFR信號轉導通路關鍵酶：磷酸化EGFR（p-EGFR）、磷酸化MAPK（p-MAPK）、磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表達水平的影響，探討其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺癌細胞株A549、SPC-A-1、H460、H1229購自中國科學院上海細胞所，西妥昔單抗由德國默克公司提供。小鼠抗erbB-2、c-myc抗體、熒光標記的抗小鼠抗體購自北京中山公司?；罴毎嫈翟噭┖?CCK-8（cell counting kit-8）購自日本株式會社同仁化學研究所。

1.2 細胞培養和分組 細胞于含10%小牛血清的DMEM培養液中常規培養。4株細胞鋪96孔板，用西妥昔單抗分別以起始濃度1 nmol/L五倍的濃度遞增，進行細胞藥物干預，同時設置好非藥空白對照。

1.3 細胞增殖檢測 通過CCK8實驗法分別測定4株人肺癌細胞株在不同藥物濃度作用下的抑制率 藥物干預72 h后分別做CCK8實驗，在每個孔內加入10 μL的CCK-8試劑。把培養板放在培養箱內培養1 h-4 h。在450 nm波長處測定吸光度，參比波長為600 nm。各藥物濃度3個重復，分別求出對各細胞的抑制率：腫瘤細胞抑制率=（1-實驗組的吸光度/對照組的吸光度）×100%，測定各組細胞72 h增殖抑制情況。

1.4 細胞凋亡檢測 對選定的經西妥昔單抗分別作用的A549、SPC-A-1兩株細胞，利用流式細胞儀方法檢測經西妥昔單抗處理后細胞所處的分裂周期。干預72 h后觀察并對3組細胞狀態顯微拍照， 碘化吡啶（PI）標記細胞凋亡情況，各組各藥濃度做一次PI凋亡流式細胞儀檢測。

1.5 細胞遷移能力檢測 收集細胞，根據凋亡和遷移能力程度的改變，檢測相應的信號通路蛋白分子在蛋白水平的變化。Western blot檢測SPC-A-1細胞信號通路蛋白相應的磷酸化蛋白p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的表達，以β-actin的水平作為等量蛋白質上樣，對照空白對照組，每個樣本重復3遍。取50 μg蛋白質樣品進行SDSPAGE電泳，轉至硝酸纖維膜上；室溫封閉2 h后，用含0.05%Tween220的TBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入相應的單克隆抗體1:800，4oC孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗1:5 000，37oC搖床溫育2 h，ECL顯色系統顯色。最后經ECL系統曝光顯影，通過凝膠分析系統分析蛋白的表達。

1.6 統計學分析 統計使用SPSS 13. 0統計軟件，數據以Mean±SD表示，統計學分析采用t檢驗和單因素方差分析進行，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 不同濃度西妥昔單抗對A549、SPC-A-1、H460、H1229細胞株增殖的抑制 在藥物作用下，4種細胞株的增殖均有下降，受到明顯的抑制，并隨著藥物濃度的增高抑制效果增強（圖1）。

2.2 不同濃度西妥昔單抗對A549、SPC-A-1、H460、H1229細胞株凋亡的影響 藥物處理細胞后，多數細胞被阻斷于G1期，并隨著藥物濃度的增加被阻斷于G1期的細胞增多。藥物連續處理細胞株后，藥物組細胞的凋亡率也均高于空白對照組（圖2）。

2.3 西妥昔單抗作用對EGFR信號通路蛋白的影響 虞永峰等[3]發現SPC-A-1細胞株EGFR表達情況較好。我們選擇Western blot檢測SPC-A-1細胞信號通路蛋白相應的磷酸化蛋白p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的表達。結果顯示：與對照組相比，西妥昔單抗作用SPC-A-1可明顯降低p-AKT、p-EGFR、p-MAPK蛋白表達水平，藥物作用與肺癌細胞信號通路蛋白表達抑制明顯相關（P＜0.001）（圖3）。

3 討論

西妥昔單抗是一個特異性針對EGFR的IgG1單克隆抗體，與非活化的EGFR的胞外結構域結合，且親和力遠高于內源性配體，可以競爭性阻斷配體與受體的結合，從而阻斷內源性配體介導的EGFR酪氨酸激酶活化[4]。目前大量臨床研究[5-8]已證實西妥昔單抗在轉移性結直腸癌以及頭頸部鱗狀細胞癌中療效確切。

單克隆抗體西妥昔單抗在肺癌治療中的運用越來越廣泛。2008年美國臨床腫瘤年會中報道的FLEX III期隨機對照研究[9]顯示，西妥昔單抗聯合化療一線治療晚期NSCLC可以顯著延長各病理類型患者的中位生存期（11.3個月 vs 10.1個月）與1年生存率（47% vs 42%）。FLEX試驗是第一個證明EGFR抑制劑靶向藥物與化療聯用可以延長生存的臨床研究，目前被2009版NCCN指南推薦作為晚期NSCLC患者的一線治療。

圖 1 西妥昔單抗作用后對各細胞株（A549、H460、H1299、SPC-A-1、95C和95D）的增殖抑制結果Fig 1 The inhibitory effects of cetuximab on proliferation of human lung cancer cells (A549, H1299, SPC-A-1, H460, 95C and 95D) treated by different concentrations of cetuximab

圖 2 西妥昔單抗作用后A549和SPC-A-1細胞凋亡圖。A：西妥昔單抗作用后A549細胞凋亡圖；B：西妥昔單抗作用后SPC-A-1細胞凋亡圖。Fig 2 The apoptosis rates of A549 and SPC-A-1 cells treated with cetuximab. A:The apoptosis rate of A549 cells treated with cetuximab; B: The apoptosis rate of SPC-A-1 cells treated with cetuximab.

圖 3 西妥昔單抗作用后SPC-A-1細胞p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的表達下調。A：西妥昔單抗作用后SPC-A-1細胞p-AKT、p-EGFR、p-MAPK的Western blot電泳圖，以β-actin為內對照；B：直方圖顯示西妥昔單抗作用SPC-A-1能明顯降低p-AKT、p-EGFR、p-MAPK蛋白表達水平。*P＜0.05。Fig 3 The expressions of p-AKT, p-EGFR, p-MAPK were downregulated in SPC-A-1 cell treated with cetuximab. A: The Western blot images of p-AKT, p-EGFR, p-MAPK in SPC-A-1 treated with cetuximab. β-actin served as internal control; B: The expressions of p-AKT, p-EGFR, p-MAPK were reduced significantly by cetuximab in SPC-A-1 cells than internal control. *P＜0.05.

西妥昔單抗作用機制為：與EGF、TGF等配體競爭EGFR分子上的特殊結合位點，阻斷配體對受體的激動作用，并通過EGFR的內吞、失活，下調其在胞膜的表達水平，還可激活抗體依賴的細胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），產生進一步的細胞殺傷效應[10]。本研究結果顯示西妥昔單抗對4株細胞株都表現出一定的體外增殖抑制作用，其抑制作用呈時間和濃度依賴性。隨著作用時間的延長，其對細胞的增殖抑制作用逐漸增強。

我們采用Westem blot法檢測經西妥昔單抗處理SPC-A-1可明顯降低p-AKT、p-EGFR、p-MAPK蛋白表達水平，藥物作用與肺癌細胞信號通路蛋白表達抑制明顯相關進一步下調了其下游信號轉導通路中活化的關鍵酶蛋白的表達，從而體現了明顯的作用。

在人肺癌細胞系的體外作用中，西妥昔單抗具有一定的抑瘤效應，其作用的分子機制是進一步下調了活化的EGFR信號轉導通路關鍵酶的表達，這為進一步的動物實驗和臨床研究、臨床用藥提供了一定的指導作用。EGFR單克隆抗體靶向治療肺癌具有良好的應用前景，值得進一步的研究。