L-菊苣酸在不同溶劑中的光致差向異構化

謝繼國,陳 波,郭建偉,姚守拙

化學生物學及中藥分析省部共建教育部重點實驗室湖南師范大學,長沙 410081

L-菊苣酸在不同溶劑中的光致差向異構化

謝繼國,陳 波＊,郭建偉,姚守拙

化學生物學及中藥分析省部共建教育部重點實驗室湖南師范大學,長沙 410081

研究了不同溶劑中L-菊苣酸在紫外光照下的穩定性。經過紫外光譜,液質聯用、旋光度核磁共振氫譜的鑒定分析,結果表明,在光照條件下L-菊苣酸會部分生成它的差向異構體,不同的溶劑中其異構化程度不同,在 365 nm,達到平衡時異構化率結果為:乙腈 ＞甲醇 ＞四氫呋喃 ＞水;在 254 nm下,則為:乙腈 ＞四氫呋喃 ＞甲醇 ＞水,且在 254 nm下比在 365 nm下異構化程度大些。

L-菊苣酸;內消旋菊苣酸;光致差向異構化

紫錐菊 (Echinacea purpurea)原產北美地區,作為免疫促進劑和免疫刺激劑而受到重視。紫錐菊中主要化學成分[1]有多糖、糖蛋白、烷基酰胺和咖啡酸衍生物,菊苣酸是其中重要的活性成分之一,能抑制透明質酸酶和抗 H IV-1整合酶[2,3],還具有抗炎,抗病毒[4],抗癌,抗氧化及清除自由基等作用。

菊苣酸有三種手性異構體[5](圖 1),天然存在紫錐菊中的為(R,R)-(-)-菊苣酸 (L-菊苣酸),據文獻報道,在水溶液中,由于菊苣酸結構中的酚羥基和酯鍵的存在,菊苣酸很不穩定,容易發生降解或氧化,加入一些添加劑[6]或者特殊儲存[7]穩定菊苣酸。文獻報道了濕度和溫度對菊苣酸穩定性[8]的影響。

本文首次報道了 L-菊苣酸的光致異構化,研究了不同溶劑對其光致異構化的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695液相分離單元 (Waters公司);Micromass ZQ2000質譜儀 (Waters公司);Flexi-DryTMMP凍干機 (美國 FTS systems);Waters Prep LC4000制備色譜儀 (Waters公司);HPD101大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工廠);RE-520旋轉蒸發儀 (上海亞榮生化儀器廠);AL204電子分析天平(梅特勒-托爾多);ZF-C型三用紫外分析儀(上海金達生化儀器有限公司)。

4%紫錐菊提取物 (購自長沙九匯現代中藥公司);菊苣酸標準品 (美國 Sigma公司);甲醇、乙酸乙酯均為分析純 (湖南師范大學試劑廠);甲酸、乙腈為色譜純 (Tedia公司);二次蒸餾水 (Milli Q純水系統)

圖 1 菊苣酸的三種立體異構體Fig.1 Structure of ciohoric acid isomers

1.2 色譜和質譜條件[9]

色譜柱:Spherigel C18(5μm,200×4.6 mm);檢測器及檢測波長:Waters 2487 detector,330 nm;進樣量 10μL;流動相:A(0.1V甲酸 +100V水)∶B(乙腈)=85∶15;流速 1 mL/min;室溫下分析。

質譜掃描模式為負離子模式 ESI-;離子源溫度: 110℃;毛細管電壓:3.0 kV;錐孔電壓:35 V;N2為脫溶劑氣體。

1.3 菊苣酸的制備及樣品處理

1.3.1 菊苣酸的制備過程

4%紫錐菊提取物的水溶液→大孔吸附樹脂HPD101→乙酸乙酯萃取→蒸干得到浸膏→浸膏上制備色譜→凍干產品 (經測定其純度約為 98%)。

1.3.2 光照產物的制備以及結構鑒定

稱取 100 mg L-菊苣酸溶于乙腈中,置于紫外燈下照射,然后用制備液相色譜分離得到其光照產物,經過高效液相色譜色譜測定純度約為98%。取一定量的L-菊苣酸及其光照產物分別進行核磁共振氫譜測定,另外分別配制 50 mg/mL的菊苣酸及其光照產物的甲醇溶液,用旋光儀測定兩者的旋光度。

1.3.3 不同溶劑中的菊苣酸的紫外光照

稱取一定量的菊苣酸,分別溶解于水、甲醇、乙腈、四氫呋喃,配制成濃度為 0.2 mg/mL的溶液,分別于 254 nm和 365 nm波長下進行紫外光照射,用HPLC-PDA-MS測定菊苣酸的變化。

2 結果與討論

2.1 菊苣酸光照產物的結構確定

圖 2 L-菊苣酸甲醇溶液及其 254 nm紫外光照后的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of the standard solution of L-cichoric acid(a)in methanol and the resulted solution(b)after irradiated underUV254nm

當把菊苣酸的甲醇溶液置于紫外燈下光照時,短時間內就可以部分地轉化成另外一種物質,如圖2所示。為了確定生成的光照產物的結構,我們分別對菊苣酸及其光照產物的質譜圖、PDA掃描圖以及1H NMR圖進行了比較分析,表 1給出了峰 1和峰 2的質譜碎片離子和分子離子的相對豐度,我們可以看出,光照產物跟 L-菊苣酸的質譜碎片離子都是一樣的,分子離子峰[M-H]-都為 473,只是碎片離子的豐度略有差別,可以初步判定峰 2為菊苣酸的異構體。再對兩物質的 PDA光譜掃描圖 (圖 3)比較,基本上沒有差別,可以排除是順反異構的可能性。最后再對比兩者的1H NMR:L-菊苣酸 (500 MHz,DMSO-d6)δ:5.684(s,2H,H-2,H-3),6.349～6.380(d,2H,J=15.5 Hz,H-8′,H-8′′),6.777～6. 793(d,2H,J=8.0 Hz,H-2′,H-2′′),7.079～7.098 (m,4H,H-3′,H-3′′,H-6′,H-6′′),7.545-7.576(d, 2H,J=15.5 Hz,H-7′,H-7′′),9.159(s,2H,C4-OH),9.684(s,2H,C5-OH)。L-菊苣酸的光照產物(500 MHz,DMSO-d6)δ:5.638～5.666(s,2H,H-2, H-3),6.344～6.376(d,2H,J=17 Hz,H-8′,H-8′′),6.771-6.787(d,2H,J=8.0 Hz,H-2′,H-2′′), 7.053-7.094(m,4H,4H,H-3′,H-3′′,H-6′,H-6′′), 7.507～7.537(d,2H,J=15 Hz,H-7′,H-7′′),9.188(s,2H,C4-OH),9.711(s,2H,C5-OH)。從而我們可以確定所產生的新物質為菊苣酸的手性異構體。

圖 3 峰 1和峰2的 PDA光譜圖Fig.3 PDA spectrums of peak1(a)and peak2(b)

菊苣酸有三種手性異構體,為了進一步確定這種異構體的構型,我們對其進行了旋光度的測定為:(25℃),測定的結果為:(L-cichoricacid)= -350°,= 0°,文獻參考值[10]isomerization product ofL-cichoric acid) =-333°,= + 340°。由此可以確定物質 2為內消旋菊苣酸 (m esochicoric acid),也就是說 L-菊苣酸在紫外光照下可以部分生成它的差向異構體。

表 1 L-菊苣酸和其光照產物的的 ESI/MS數據Table 1 The negative ion ESI/MS spectrums data of peak 1 and peak 2

2.2 不同溶劑對菊苣酸光致差向異構化的影響

為了進一步研究不同溶劑對菊苣酸光致差向異構化的影響,我們考察了菊苣酸在四種溶劑中的異構化情況以及不同波長(254 nm和 365 nm下)對異構化的影響,如圖 4所示,分別為在甲醇、四氫呋喃、乙腈、水中的結果。在 254 nm下,一開始時,隨著光照時間的增長。四種溶劑中菊苣酸差向異構體的含量都增大,當光照 1.5 h后,異構體的含量基本上保持不變,異構化反應達到平衡。不同溶劑中,異構化程度差別較大,在水,甲醇,乙腈三種常用的反相色譜溶劑中,隨著極性的減小,異構轉化率增加。但是在四氫呋喃中,極性減小,異構化轉化率小于在甲醇和乙腈中的,水中的最小,達到平衡時異構化率大小順序為:乙腈 ＞四氫呋喃 ＞甲醇 ＞水。在 365 nm下,光照 0.5 h后就達到了平衡,平衡時的異構化率大小為:乙腈 ＞甲醇 ＞四氫呋喃 ＞水。在同一種溶劑中,波長也影響最后異構化平衡時的轉化率,波長越短,異構化程度越高,且在四氫呋喃中兩個不同波長下最后的平衡轉化率相差較大。

3 結論

在不同溶劑中,L-菊苣酸在紫外光照下都會部分地轉化為其差向異構體 (在不同溶劑中異構化情況不一樣)。就考察的四種溶劑來說,在 254 nm下,達到平衡時異構化率結果為:乙腈 ＞四氫呋喃 ＞甲醇 ＞水。在 365 nm,則為:乙腈 ＞甲醇 ＞四氫呋喃 ＞水。另外,紫外光照的波長越短,異構化程度越高。

圖 4 在不同溶劑中菊苣酸差向異構體含量隨光照時間的變化圖Fig.4 Relationship between epimerization rates ofL-cichoric acid with irradiation time in different solvents a.甲醇Methanol;b.四氫呋喃 Tetrahydrofuran;c.乙腈Acetonitrile;d.水Water

1 Bauer R. Immunomodulatory agents from plants.Basel,Switzerland:BirkhauserVerlag,1999.41-88.

2 Anni P,Denis B,Etienne S,et al.4-Oxo-ionol and linalool glycosides from raspberryfruits.Phytochem istry,1992,31: 4187.

3 King PJ,RobinsonWEJ.Resistance to the anti-human immunodeficiency virus type 1 (H IV-1)compound,L-chicoric acid results from a singlemutation at amimo acid 140 of integrase.J V irol,1998,72:8420-8424.

4 WackerA,HilmigW.Virushemnug untEchinnacea purpurea(virsus-inhibition by Echinecea purpurea).Planta M edica, 1978,33:89-102.

5 Scarpati ML,Oriente G.Chicoricacid(dicaffeyltartaric acid):its isolation from chicory and synthesis.Tetrahedron, 1958,4:43-48.

6 Nusslein B,Kurzmann M,Bauer R.J Nat Prod,2000,63: 1615-1618.

7 DouglasLS,RonBHW.Effectof drying temperature on alkylamide and cichoric acid.J Agric Food.Chem,2003,51: 1608-1610.

8 ChantalBergeron.J Agric Food Chem,2002,50:3967-3970.

9 Luo XB,Chen B,Yao SZ,et al.Simulaneous analysis of caffeic acid derivatives and alkamides in roots and extracts ofEchinacea purpureaby high perfor mance liquid chromatography-photodiode array detetion-electrospray mass spectrometry.J Chrom atogrA,2003,986(1):73-81.

10 Zhao H,Burke TR.Facile synthesis of(2R,3R)-(-)and (2S,3S)-(+)-chicoric acids.Synthetic comm unications, 1998,28:737-740.

Photoep imerization of L-C ichoric Acid in D ifferent Solvents

XIE Ji-guo,CHEN Bo＊,GUO Jian-wei,YAO Shou-zhuo
Key Laboratory of Chem ical B iology&Traditional ChineseM edicine Research, M inistry of Education,Hunan Nor mal University,Changsha 410081,China

The photoepimerization ofL-cichoric acidwas investigated.When the solution ofL-cichoric acidwas irradiated with the UV light,L-cichoric acid was converted to another compound partially.W ith the separation and identification by HPLC-MS,UV spectrum,optical rotation,and1H NMR,the results demonstrated that L-cichoric acid could partially be epimerized tomeso-cichoric acid.The rates of epimerization ofL-cichoric acid in different solvents had significant differences.At 365 nm,the ratio of epimerization at the equilibrium state isordered as follows:acetonitrile＞methanol＞tetrahydrofuran＞water.While at 254 nm,the order is:acetonitrile＞ tetrahydrofuran＞methanol＞water.In addition, the ratio of epimerization at 254 nm ismore than that at 365 nm.

L-cichoric acid;m eso-cichoric acid;photoepimerization

R284.1;Q946.91;R932

A

1001-6880(2010)04-0630-04

2008-11-24 接受日期:2009-02-05

國家“973”基金項目(2006CB504701)

＊通訊作者 Tel:86-731-8865515;E-mail:dr-chenpo@vip.sina.com