水溶性殼聚糖與牛血清白蛋白相互作用的研究

馮小強,伏國慶,李小芳,楊 聲＊

1天水師范學院生化學院;2天水市中醫醫院化驗科,甘肅天水 741001

水溶性殼聚糖與牛血清白蛋白相互作用的研究

馮小強1,伏國慶2,李小芳1,楊 聲1＊

1天水師范學院生化學院;2天水市中醫醫院化驗科,甘肅天水 741001

采用紫外和熒光光譜研究了水溶性殼聚糖 (CS)與牛血清白蛋白 (BSA)之間的相互作用。結果表明:隨 CS濃度的增加,BSA的紫外吸收光譜表現出明顯的增色效應和較小的紫移;CS可以猝滅 BSA的內源熒光,其猝滅機理是 CS與BSA形成復合物的靜態猝滅。并且測定了在不同溫度下,該反應的結合常數 KA分別為6.92×106(298 K),5.01×106(308 K),3.31×106(318 K),CS與 BSA以摩爾比 1∶1結合。同時采用同步熒光光譜法探討了 CS對BSA構象的影響。

水溶性殼聚糖;牛血清白蛋白;紫外光譜;熒光光譜

殼聚糖(簡稱CS)是甲殼素脫乙?；蟮漠a物,具有無毒、生物相溶、可降解、廣譜抑菌等特性,在醫學、食品營養學、環境保護、輕工業等領域有著極為廣泛的應用[1]。血清白蛋白能和許多內源性和外源性物質結合,攜帶這些物質在體內進行轉運、分配和代謝,在體內起著酸度保持、金屬離子、氨基酸、脂肪酸、藥物等的貯存、運載等重要的作用[2],是基礎科學研究中最常用的藥物靶蛋白之一[3,4]。有關蛋白質的結構和功能研究,是目前生命科學、化學和醫學界共同關注和感興趣的課題[5],因此研究藥物與血清白蛋白的相互作用對闡明藥物的作用機制具有重要的理論意義。關于 CS與BSA的相互作用未見文獻報道。本文在生理 pH條件下研究 CS與 BSA的相互作用,討論了 CS對 BSA內源熒光的猝滅機制,經過計算得到了 CS與 BSA之間的結合常數和結合位點數。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

殼聚糖 (水溶性 60目濟南海德貝海洋生物工程有限公司);0.05 mo1/L的 Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4,含 0.1 mo1/L NaCl以維持溶液離子強度),并以此為溶劑配制 1.0×10-5mo1/L的牛血清白蛋白 (BSA,北京奧博星生物技術責任有限公司)標準溶液。

RF-5301PC型熒光分光光度計 (日本島津); UV-2450紫外可見分光光度計 (日本島津);Spectrum One傅立葉紅外光譜儀 (Perkin E lmer)。

1.2 實驗方法

在 10 mL比色管中依次加入 2.0 mL Tris-HCl緩沖溶液,2.0 mL BSA溶液和一定量的 CS溶液,以Tris-HCl緩沖溶液定容為 10 mL,分別在 25、35、45℃下作用 30 min。設定激發和發射狹縫寬度均為 3 nm,λex=280 nm,在 300～450 nm范圍內測定的BSA及 CS作用下 BSA的熒光光譜;固定激發和發射波長間隔Δ λ=60 nm,記錄同步熒光光譜;在 220～500 nm范圍內測定其紫外吸收光譜。

2 結果與討論

2.1 BSA與 CS相互作用的紫外光譜

動態猝滅只影響熒光分子的激發態,并不改變熒光物質的吸收光譜;在靜態猝滅中,由于猝滅劑與猝滅物質的基態分子發生相互作用,形成基態配合物,從而引起紫外吸收光譜的變化[6]。由圖 1可見,隨著 CS的加入,BSA在 280 nm處吸收強度逐漸增強,峰位緩慢紫移,在 280 nm處吸收峰位紫移到277 nm,表明 CS與BSA混合后發生了相互作用,生成了一種復合物。BSA在 280 nm處的吸收峰是其肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的苯雜環π-π＊躍遷引起的,吸收強度隨 CS濃度的增加而增強,說明 CS配位誘導BSA分子發生類似降 pH值所出現的蛋白質肽鏈伸展現象[7],使包圍在 BSA分子內部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環疏水基團裸露出來,使吸收強度增強,同時疏水基團之間的疏水作用減弱,ππ＊躍遷能量增大,使吸收峰發生藍移。

2.2 BSA與 CS相互作用的紅外光譜

在 4000～600 cm-1區域測定了 CS、BSA和BSA/ CS配合物的 I R光譜。配合物與 BSA的 IR光譜相比較,某些吸收峰的振動頻率和強度有明顯的區別。BSA中νN-H伸縮的 3413 cm-1帶,在配合物中變成寬峰;BSA中νC-H伸縮的 2929 cm-1帶,在配合物中發生巨大的變化。這表明BSA與 CS作用形成配合物時,端基及殘基上的氮原子參與成鍵且有氫鍵締合作用。BSA酰胺Ⅰ帶的νCOO-的反對稱伸縮振動的 1638 cm-1帶,在配合物中變成 1646 cm-1;酰胺Ⅱ帶的νCOO-的反對稱伸縮振動的 1618 cm-1帶,在配合物中移至 1598 cm-1。由此可知,BSA羥基上的氧和酰胺帶Ⅰ的氮與 CS有直接的鍵合作用。

圖 1 CS對BSA的紫外吸收光譜的影響Fig.1 Effect of CS on the absorption spectra ofBSA. CCS1～7∶0,0.125,0.25,0.375,0.5,0.625 and 0.75 mg/mL,respectively.

圖 2 CS、BSA和BSA/CS配合物的 I R光譜Fig.2 IR spectra of CS,BSA and BSA/CS.

2.3 熒光光譜

2.3.1 熒光猝滅光譜

蛋白質分子中因含有色氨酸 (Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸 (Phe)等氨基酸殘基而產生內源性熒光,而 CS不發熒光。在大多數情況下,蛋白質的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻,且含色氨酸殘基的天然熒光及變化直接反映了蛋白質中色氨酸殘基本身及其周圍環境的變化。當某些小分子如藥物與蛋白質結合后,導致其熒光強度下降,稱為熒光猝滅作用。

固定BSA溶液濃度不變,向其中加入不同濃度的 CS溶液,結果發現:在激發波長為 280 nm時, BSA的最大發射波長為 339 nm;而殼聚糖在λem= 339 nm無熒光產生。隨著 CS濃度的增加,BSA內源熒光強度有規律地降低,但發射峰位的位置和峰形變化不大(圖 3),這說明 CS對 BSA的熒光有猝滅作用。且隨著 CS濃度的增加,熒光的最大發射波長逐漸藍移,表明色氨酸疏水性增強。

圖3 CS對BSA的熒光猝滅圖Fig.3 The effect of CS on the fluorescence spectra ofBSA CCS1～7∶0,0.125,0.25,0.375,0.5,0.625 and 0.75 mg/mL,respectively.

2.3.2 熒光猝滅機理

熒光猝滅分為 3種:動態猝滅、靜態猝滅和發生非輻射能量轉移。動態猝滅只影響熒光分子的激發態,并不改變熒光物質的吸收光譜;在靜態猝滅中,由于猝滅劑與猝滅物質的基態分子發生相互作用,形成基態配合物。動態猝滅符合 Stern-Vo lmer方程:

其中 F0為未加猝滅劑時的熒光強度;F為加入猝滅劑后的熒光強度;kq為雙分子猝滅過程的速率常數;τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命;ksv為 Stern-Vo lmer猝滅常數,是雙分子猝滅速率常數與單分子衰變速率常數的比率;CQ為猝滅劑的濃度,mol.l-1。

靜態猝滅是猝滅劑和熒光物質分子在基態時生成不發光的締合物,從而導致熒光物質熒光強度降低的過程.若 KSV為動態猝滅常數,由于生物大分子的熒光壽命τ0約為 10-8s,各類猝滅劑對生物大分子的 Kq最大值為 2.0×1010L·mol-1·s-1[8]。

對不同溫度下BSA相對熒光強度 F0/F對猝滅劑 CS的濃度作 Stern-Volmer曲線 (圖 4),發現 BSA相對熒光強度 F0/F與 CS濃度呈良好的線性關系。直線斜率為 Stern-Volmer熒光猝滅常數 ksv,結果列于表 1。由表 1結果可知,在不同溫度下,CS對BSA的猝滅速率常數遠遠大于最大擴散控制的速率常數,可以初步判斷 CS對BSA的熒光猝滅可能是屬于生成復合物的靜態猝滅。

此外,動態與靜態猝滅也可依據不同溫度下的猝滅常數得以區別。對動態猝滅,溫度升高將有利于熒光體和熒光猝滅劑分子之間的有效碰撞,并可以促進電子的轉移過程,Ksv隨溫度的升高而增大;若是靜態猝滅,溫度升高,產物的穩定性降低,靜態猝滅常數 Ks減小[9]。在該研究體系中,CS對 BSA的熒光猝滅曲線斜率隨溫度的升高而降低,即猝滅常數隨溫度的升高而減小,這進一步表明 CS對BSA的熒光猝滅作用不是由擴散和碰撞引起的動態猝滅,而是生成復合物的靜態猝滅[10]。

圖 4 不同溫度下 CS與BSA作用的 Stern-Vo lmer圖Fig.4 Stern-Volmer plots of the interaction of CS and BSA at different temperatures

表 1 不同溫度下 CS對 BSA熒光猝滅的 Stern-Volmer方程與猝滅常數Table 1 Stern-Volmer equation s and quenching constants for BSA fluorescence quenchingwith chitosan at different temperatures

熒光能量轉移可分為輻射能量轉移和非輻射能量轉移。若發生輻射能量轉移,會導致物質的熒光光譜畸形。圖 4中BSA的熒光光譜都沒有畸變,因此BSA與 CS之間的能量轉移不應為輻射能量轉移。同時 CS的熒光被敏化 (圖 5),在 562 nm左右出現一個熒光發射峰。相應的熒光強度隨與 CS結合的BSA的量增加而增加,這說明BSA分子與 CS之間存在能量轉移,即 BSA與 CS有配位作用。非輻射能量轉移包括分子內能量轉移和分子間能量轉移。若供能體與受能體結合生成了復合物,則兩者之間的能量轉移為分子內能量轉移,否則為分子間能量轉移。由上述分析可知,BSA與 CS之間的能量轉移應屬于分子內的非輻射能量轉移。

圖 5 BSA溶液對CS熒光光譜的影響Fig.5 Emission spectra of CS in the presence and absence of BSA(CCS=0.5 mg/mL)

在 CS對BSA的熒光靜態猝滅過程中,假設生物大分子BSA有n個相同且獨立的結合位點,可與猝滅劑 CS結合常數為 kA,則BSA與 CS的配合反應可表示為:

當 CS的濃度遠遠大于 BSA濃度時,熒光體系的熒光強度和 CS的濃度滿足以下關系:

一定濃度的BSA溶液中加入不同濃度的 CS溶液,根據方程 (3),由圖 6 lg(F0– F)/F～lgC(CS)曲線擬合得到方程、平衡常數和結合位點數列于表2?？梢钥闯?CS與BSA的結合位點數均等于 1,說明每一個BSA分子與一個 CS分子結合形成配合物,其結合常數隨溫度升高而減小,這是因為當溫度升高,有利于BSA與 CS結合產物的解離,使得平衡常數減小。

2.4 同步熒光光譜

藥物分子與蛋白質分子結合,不但直接猝滅了氨基酸殘基的熒光,而且還與周圍鄰近的氨基酸殘基相互作用,導致蛋白質構型和構象的改變。這種作用的結果可能阻斷氨基酸殘基之間能量轉移的途徑并影響氨酸殘基周圍的微環境,從而使蛋白質的熒光強度改變且使熒光峰發生位移。

BSA的空間結構由 3個結構域組成,每個結構域由 2個亞結構域以槽口相對的方式形成圓筒狀結構,幾乎所有疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內部,構成疏水腔[11]。對于蛋白質的同步熒光光譜,Δ λ =60 nm時僅表現出色氨酸殘基的熒光[9]。因為氨基酸殘基的最大發射波長與其所處環境的疏水性有關,所以由發射波長的改變可判斷蛋白質構象的變化。在室溫下,固定 BSA濃度,逐漸增大 CS的濃度,記錄Δ λ=60 nm時的同步熒光光譜(圖 7)。發現隨 CS濃度的逐漸增大,色氨酸殘基的最大發射波長峰位置都略藍移且強度逐漸降低,表明 CS的加入使BSA的構象發生變化,色氨酸殘基所處環境的親水性減小,導致 BSA腔內疏水環境增強[12]。這與吸收光譜和熒光發射光譜藍移相吻合。

圖 7 CS對BSA同步熒光光譜的影響Fig.7 Effects of CS concentrations on synchronous fluorescence spectra ofBSA

3 結論

采用吸收光譜和熒光光譜法研究了 CS與BSA相互作用,確定了 CS對 BSA的猝滅過程為靜態猝滅機制。CS可能進入BSA內而與BSA的 Trp殘基間發生非輻射能量轉移,形成弱的熒光體,阻礙BSA內部 Tyr殘基與 Trp殘基間的能量轉移,猝滅了BSA的內源熒光,導致BSA發生熒光猝滅。在不同溫度下CS與BSA的結合常數 KA分別為 6.92×106(298 K),5.01×106(308 K),3.31×106(318 K), CS與BSA以摩爾比 1∶1結合。

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The Interaction of Chitosan with Bovine Serum Album in

FENG Xiao-qiang1,FU Guo-qing2,L IXiao-fang1,YANG Sheng1＊

1College of B iology and Chem istry,Tianshui Nor m al Univerity;2Tianshui Traditional ChineseM edical Hospital,Tianshui 741001,China

The interaction between chitosan(CS)and Bovine Serum Albumin(BSA)was studied via ultraviolet-visible absorption and fluorescence spectra.The results showed that the ultraviolet absorption intensity ofBSA increased as the concentration of CS increased.The fluorescence of BSA is quenched regularly by CS,which belonged to static fluorescence quenching.The binding constants(KA)were 6.92×106(298 K),5.01×106(308 K)and 3.31×106(318 K), respectively,and they reacted at a molar ratio of 1∶1.CS on the confor mation ofBSA was analyzed by synchronous fluorescence spectra.

water-solubility chitosan;bovine serum albumin;ultraviolet spectrum;fluorescence spectrum

O636.1

A

1001-6880(2010)05-0894-05

2009-09-04 接受日期:2009-12-08

甘肅天水師范學院物理無機化學重點學科基金資助

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:ysh@mail.tsnc.edu.cn