重組人kallistatin蛋白在畢赤酵母中的高效表達及生物活性分析

黃曉平，王曉，董浩，趙小峰，李招發,2，王啟釗,2，許瑞安,2，刁勇,2

1 華僑大學分子藥物學研究所，泉州 362021 2 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

重組人kallistatin蛋白在畢赤酵母中的高效表達及生物活性分析

黃曉平1，王曉1，董浩1，趙小峰1，李招發1,2，王啟釗1,2，許瑞安1,2，刁勇1,2

1 華僑大學分子藥物學研究所，泉州 362021 2 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

為了研究kallistatin(Kal)的生物活性，本實驗構建了可分泌表達Kal的畢赤酵母菌株。首先通過PCR方法從pAAV-Kal中擴增出Kal cDNA，并克隆至酵母表達載體pPIC9，得到甲醇酵母分泌型表達載體pPIC9-Kal，然后將載體線性化并電擊轉化畢赤酵母GS115(his4)，通過MD平板篩選出陽性表達菌株。陽性表達菌株在BMMY培養基(pH 7.0)中29℃培養，經2%甲醇誘導表達96 h，搖瓶表達量可達14 mg/L。表達上清經Phenyl Superose、Heparin Sepharose FF分離純化，目的蛋白純度達到98%，分子量為58 kDa。生物活性實驗顯示，所得到的Kal蛋白具有較好的抗氧化活性，過氧化物酶活性達到(163±4)U/(mg·min)，可有效降低H2O2對LX-2細胞的氧化損傷。另外，重組產生的Kal還能抑制HUVEC細胞的增殖。本研究首次成功地利用畢赤酵母表達系統分泌表達了有生物活性的Kal，為繼續開展其抗腫瘤活性奠定了基礎。

kallistatin，畢赤酵母，表達，活性

Abstract:In order to research the bioactivity of kallistatin(Kal), we obtained the recombinant Kal using Pichia pastoris expression system.Kal cDNA was amplified from pAAV-Kal and inserted into pPIC9 vector to generate a recombinant vector of pPIC9-Kal.Then, pPIC9-Kal was linearized and transformed into Pichia pastoris strain GS115(His4)by electroporation.The positive transformants were selected by MD plate and confirmed by PCR.High level of Kal was obtained in BMMY medium(pH 7.0)after 96 hours induction of 29°C and 2% methanol, with the highest yield of 14 mg/L in shake flask culture.Kal protein was purified from the supernatant with Phenyl Superose and Heparin Sepharose FF chromatograph.The recombinant Kal had a molecularweight of 58 kDa with 98% purity, showing by SDS-PAGE.Moreover, it had a high peroxidase activity(163±4)U/(mg·min), which could protect LX-2 cell against oxidation of H2O2.Recombinant Kal also effectively inhibited HUVEC proliferation.In this report,we successfully established the expression system using Pichia pastoris and obtained the bioactive recombinant human Kal.It lays a foundation for its further anti-cancer therapy.

Keywords:kallistatin, Pichia pastoris, expression, activity

Kallistatin(Kal)是由401個氨基酸組成、分子量為58 kDa的內源性蛋白，具有多種生物學活性，如降血壓[1]、舒張血管[2]、促進血管新生內膜的形成[3]、抗炎[4]和抗氧化[5]等。最近的研究表明，Kal具有廣譜的抗腫瘤活性，符合抗腫瘤藥物應具有多靶點和多信號通路阻斷的要求，值得深入開發。其抗血管生成作用與已上市藥物內皮抑素(Endostatin)類似，可以與VEGF和bFGF等生長因子競爭結合硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)受體，因此可阻斷這些生長因子引發的血管生成。本課題組發現，在Kal的作用下，腫瘤細胞中作為細胞增殖的標志物Ki-67染色降低，顯示 Kal可以直接抑制腫瘤細胞增殖[6]。Kal可以從不同途徑抑制血管生成，是腫瘤抗血管生成治療的良好候選者，又可以直接作用于腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞增殖，是一種廣譜的抗腫瘤內源性因子。

1989年Chao等[7]首次從人血漿中分離出 Kal蛋白，并鑒定其為激肽釋放酶(Kallikrein)抑制蛋白，主要功能集中于心血管系統，如降血壓、舒張血管、促進血管新生內膜形成等。1993年Chao等[8]曾采用大腸桿菌表達Kal重組蛋白，但表達量很低。之后進行的 Kal的功能研究，基本上均采用基因轉導的方法進行。在最近一篇有關 Kal抗炎和抗氧化的研究論文中，Chao等提議應開展Kal蛋白的功能研究[4]。

自從 2002年Miao等[6]首次報道 Kal具有抑制新生血管生成，并抑制腫瘤生長的作用后，其抗腫瘤活性引起廣泛的關注。本課題組采用基因治療的方法，進行了大量的 Kal抗腫瘤作用的研究，發現Kal基因藥物具有廣譜的抗腫瘤活性，既可以抑制腫瘤新生血管的形成[9-10]，又可以直接誘導腫瘤細胞的凋亡，具有很好的開發前景。但研究采用的方法均為基因治療手段，而基因治療一般需要采用病毒載體，其長期應用的風險是各國衛生部門重點關注的問題，目前尚不明朗，很難在短期內實現上市并廣泛應用于腫瘤病人。而多種重組蛋白藥物已廣泛地應用于臨床，相關技術比較成熟，是開發基因重組藥物最常規的手段。所以本實驗試圖建立一種高效生產 Kal重組蛋白的方法，研究其蛋白形式對腫瘤的作用，為新型抗腫瘤藥物的開發奠定基礎。

本課題組也曾用E.coli表達人Kal蛋白，但表達量極低，且雜蛋白多難以純化。畢赤酵母表達系統是近年來建立起來的一種真核表達系統，已成功地表達了大量的重組蛋白[11]，它既具有原核表達系統繁殖快、操作簡單的優點，同時又具有原核表達系統所沒有的優勢：如能對表達的目的蛋白進行正確加工、折疊及適度糖基化，分泌表達的雜蛋白少，易于分離純化等，因此越來越廣泛地用于重組蛋白的表達。國內外文獻尚未有利用畢赤酵母表達 Kal蛋白的報道。本研究利用畢赤酵母表達人Kal蛋白，以克服用E.coli表達人Kal蛋白遇到的表達量小、雜蛋白多難以純化的困難。所表達純化的人 Kal蛋白能有效地抑制血管內皮細胞 HUVEC的增殖，且表現出很好的過氧化物酶等生物活性，有望進行深度的抗腫瘤藥物開發研究。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli DH5α、GS115(His4)、pPCI9 和 pAAV-Kal均為本實驗室保存。血管內皮細胞(HUVEC)購自ScienCell。T4 DNA連接酶為NBI公司產品。Xho I、EcoR I、Stu I等內切酶購自大連寶生物公司。凝膠回收試劑盒購自OMGE公司。酵母氮基(含硫酸銨/無氨基酸Yeast Nitrogen Base)購自BD公司。D-生物素、D-山梨醇(D-Sorbitol)購自Sigma公司。層析介質Heparin Sepharose FF、Phenyl Superose均購自Amersham Pharmacia Biotech(GE)公司。鼠抗人kallistatin單抗、山羊抗鼠二抗均購自Santa Cruz。ELISA試劑購自R & D公司。

1.2 方法

分子生物學操作參見《細胞生物技術實驗指南》[11]，酵母發酵操作參見Invitrogen公司的Pichia Fermentation Process Guidelines操作手冊，純化介質的使用參見GE公司的實驗手冊。

1.2.1 表達載體pPIC9-kal的構建

選用pAAV-Kal為模板，上游引物HK-F5: 5′-aac ctcgag aaaagagatggtgagagttgcagtaacagct-3′(下 劃 線部分為Xho I酶切位點)和下游引物HK-R5:5′-ccag aattc ctatggtttcgtggggtcgacgacc-3′(下 劃 線 部 分 為EcoR I酶切位點)，用Pyrobest DNA聚合酶，經PCR得到人Kal成熟蛋白對應的DNA。目的片段回收、酶切后插入至pPIC9載體的Xho I/EcoR I位點之間。轉化后經菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，委托大連寶生物公司對pPIC9中插入的Kal基因序列進行測序。

1.2.2 工程菌株的構建與鑒定

pPIC9-Kal表達載體經Stu I線性化，電轉化畢赤酵母GS115(His4)宿主菌，涂布MD平板，菌落PCR鑒定。將陽性克隆接種于含有3 mL BMMY酵母培養液的試管中，培養24 h，用2%甲醇誘導48 h，ELISA法測定目的蛋白含量。發酵上清液經SDS-PAGE分離后電轉至硝酸纖維素膜上，用封閉液封閉2 h，滴加一抗室溫孵育2 h，洗滌液洗3次，滴加二抗室溫孵育 2 h，洗滌液洗 3次，最后使用BeyoECL熒光檢測試劑檢測目的蛋白，X膠片曝光后顯影、定影。

1.2.3 發酵條件的優化

對篩選出的陽性菌株進行發酵培養基、pH、培養時間、甲醇濃度等條件的優化，以得到搖瓶內最佳發酵工藝，為在反應器內批量生產奠定條件。

1.2.4 Kal蛋白的分離純化

發酵上清液經硫酸銨溶液(終濃度 1.5 mol/L)預處理后，通過疏水作用(Phenyl Sepharose)及肝素親和(Heparin Sepharose FF)兩步層析得到 Kal蛋白，SDS-PAGE電泳檢測純度。

1.2.5 表達產物活性分析

1)Kal蛋白對血管內皮細胞HUVEC增殖的影響：采用DMEM培養基(含10% FBS)培養HUVEC細胞，待細胞豐度達到80%，以0.25%胰酶消化，制備成1×105細胞/mL的細胞懸液，接種至96孔板，100 μL/孔。貼壁后按照設置的濃度梯度加入Kal蛋白，孵育48 h后MTT法檢測細胞存活率。

2)Kal蛋白過氧化物酶活性的測定：利用愈創木酚法測定重組 Kal蛋白的過氧化物酶活性。將波長470 nm處反應體系每分鐘吸光值A變化0.01定義為一個過氧化物酶活性單位(U/(mg·min))。實驗重復3次，得出純化后的重組Kal蛋白過氧化物酶活性。

3)Kal蛋白抗氧化作用：利用H2O2對LX-2細胞的氧化模型來研究 Kal蛋白抗氧化作用。以DMEM培養LX-2至豐度達到80%，0.25%胰酶消化，制備成1×105細胞/mL的細胞懸液，接種至 96孔板，每孔100 μL。貼壁后按照設置的濃度梯度分別加入Kal蛋白和GSH，隨后加入H2O2(終濃度為300 μmol/L)氧化刺激，培養48 h后MTT法檢測細胞存活率。

2 結果與分析

2.1 表達載體pPIC9-Kal的構建與鑒定

PCR法從pAAV-Kal中擴增人Kal基因序列，回收DNA片段長度約1200 bp，與預計值相符。Xho I/EcoR I酶切PCR產物與pPIC9載體連接并轉化至E.coli DH5α感受態細胞；菌落PCR、質粒酶切圖譜(圖1)及測序結果顯示pPIC9-Kal重組質粒構建成功。

2.2 工程菌株的構建與篩選

pPIC9-Kal經 Stu I線性化后，電轉化 GS115(His4)宿主菌，涂布MD平板，經菌落PCR擴增出1200 bp片段的菌落為陽性克隆(圖2)。陽性克隆按甲醇酵母發酵的常規方法進行發酵。3個候選克隆的發酵液經ELISA法測定，均檢出Kal蛋白的表達，其中 1個克隆表達水平較高，其發酵液經 Western blotting分析，呈現Kal表達陽性結果(圖3)，而未轉化的GS115/pPIC9菌落未檢出Kal。

圖1 重組表達質粒pPIC9-Kal的PCR和酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant expression vector pPIC9-Kal by PCR and enzyme digestion.1: DNA ladder; 2: pPIC9-Kal digested with EcoR I and Xho I; 3: pPIC9-Kal digested with EcoR I; 4: pPIC9-Kal; 5?7: PCR products of pAAV-Kal, E.coli DH5α/pPIC9-Kal, and pPIC9-Kal.

圖2 菌落PCR法鑒定GS115(His4)陽性轉化子Fig.2 GS115(His4)positive transformants identified by PCR.1: DNA ladder; 2: pAAV-Kal cDNA; 3?5: GS115/pPIC9-Kal cDNA; 6: GS115/pPIC9 cDNA.

圖3 Western blotting鑒定發酵液中的Kal蛋白Fig.3 Western blotting analysis of Kal expression in fermentation supernatant.1: sample from GS115 /pPIC9; 2: sample from GS115/pPIC9-Kal.

2.3 發酵條件的優化

2.3.1 培養基

選取 BMM和 BMMY兩種常用培養基進行培養，將培養上清進行電泳分離，BMMY培養基的上清液可見清晰的Kal條帶，而 BMM培養基的上清液中Kal蛋白條帶非常模糊。經ELISA測定BMM、BMMY培養基中的Kal表達水平見表1?？赡苡捎贐MM培養基缺少胰蛋白胨和酵母浸膏，導致水解蛋白酶將誘導表達的Kal蛋白水解。

2.3.2 pH值

選用不同pH的BMMY培養基進行發酵，ELISA測得發酵上清液中 Kal蛋白含量(表 2)?？梢娫摼N表達的最佳pH值為7.0。

2.3.3 甲醇濃度

選用不同濃度的甲醇誘導 Kal蛋白的表達，ELISA法測得發酵上清液 Kal蛋白含量(表3)?？梢娬T導Kal蛋白表達的最佳甲醇濃度為2%。

2.3.4 發酵時間

在不同的發酵時間取樣，ELISA法測定發酵上清中Kal蛋白含量。隨著發酵時間的延長，Kal的表達逐漸增加，產物的時間積累效果顯著，在96 h達到最高水平(圖4)，之后上清中雜蛋白條帶增多，Kal蛋白含量降低(圖5)。

表1 培養基成份對Kal蛋白表達量影響(±s，n=3)Table 1 Effect of culture medium on the expression of Kal(±s, n=3)

表1 培養基成份對Kal蛋白表達量影響(±s，n=3)Table 1 Effect of culture medium on the expression of Kal(±s, n=3)

Medium Kal concentration(mg/L)BMM 4.6±0.9 BMMY 13.6±1.2

表2 pH對Kal蛋白表達量影響(±s，n=3)Table 2 Effect of pH on the expression of Kal(±s, n=3)

表2 pH對Kal蛋白表達量影響(±s，n=3)Table 2 Effect of pH on the expression of Kal(±s, n=3)

pH Kal concentration(mg/L)5.0 5.4±0.8 6.0 8.0±1.2 7.0 14.0±1.4 8.0 12.2±0.7

表3 甲醇濃度對Kal蛋白表達影響(±s，n=3)Table 3 Effect of methanol concentration on the expression of Kal(±s, n=3)

表3 甲醇濃度對Kal蛋白表達影響(±s，n=3)Table 3 Effect of methanol concentration on the expression of Kal(±s, n=3)

Methanol concentration(%)Kal concentration(mg/L)0.25 1.8±0.5 0.5 3.5±0.6 1 9.5±1.1 2 13.8±1.1

圖4 發酵時間對重組Kal蛋白表達的影響(±s, n=3)Fig.4 Effects of fermentation time on the expression of Kal(±s, n=3).

圖5 發酵時間對重組Kal蛋白表達的影響Fig.5 Effects of fermentation time on the expression of Kal,the arrow indicates the band of Kal.1: protein marker; 2:GS115/pPIC9 incubated for 96 h; 3–7: GS115/pPIC9-Kal incubated for 24 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h, respectively.

2.4 Kal蛋白的純化條件

Kal蛋白純化過程包括發酵上清液的硫酸銨預處理和連續的兩步層析：預處理后的上清液經過Phenyl Superose介質疏水層析，平衡緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl，1.5 mol/L 硫酸銨，pH 6.0，用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.4 mol/L硫酸銨，pH 6.0)洗脫；洗脫液透析后經過Heparin Sepharose FF介質親和層析，用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，pH 6.0)洗脫，此步洗脫液經過透析后過濾除菌就得到Kal蛋白原液。純化的Kal蛋白經Western blotting鑒定為陽性，用ELISA測定Kal蛋白原液濃度為0.404 mg/L。通過該純化工藝，可以從每升發酵上清中獲得7 mg純度大于98%的Kal蛋白。純化過程中Kal蛋白產物的純度分析見圖6。

2.5 活性分析

2.5.1 對血管內皮細胞HUVEC增殖的影響

將 HUVEC細胞(1×105細胞/mL)接種至 96孔板，每孔100 μL，細胞貼壁后加入重組Kal蛋白，培養48 h 后MTT法檢測細胞活性。結果發現，3 μmol/L Kal蛋白組抑制率為55%±3%，1.5 μmol/L Kal蛋白組抑制率為25%±3%，0.75 μmol/L Kal蛋白組抑制率為12%±3%，表現出量效關系，陽性對照藥內皮抑素(3 μmol/L)抑制率為 35%±4%(圖7)。

2.5.2 過氧化物酶活性

利用愈創木酚法測得純化后的 Kal蛋白的過氧化物酶的比活為(163±4)U/(mg·min)。

2.5.3 抗氧化作用

將 LX-2細胞(1×105細胞/mL)接種至 96孔板，每孔 100 μL，貼壁后加入 Kal蛋白(終濃度0.6 μmol/L和 0.2 μmol/L)，陽性對照組加入 GSH(0.6 μmol/L)，隨后加入 H2O2(終濃度 300 μmol/L)。12 h后陰性對照組細胞變圓、死亡，而加入Kal蛋白和GSH的細胞狀態良好。培養48 h后經MTT法檢測，結果陰性對照組細胞存活率為 51%±5%，而加入0.6 μmol/L Kal蛋白組細胞存活率為102%±10%，加入0.6 μmol/L GSH組細胞存活率為85%±7%(圖8)。

圖6 SDS-PAGE法分析純化過程中重組Kal蛋白的純度Fig.6 SDS-PAGE analysis of different products from Kal purification process.1: protein marker; 2: fermentation supernatant of GS115/pPIC9-Kal; 3: purified of Phenyl Superose; 4: purified of Heparin Sepharose FF.

圖7 Kal蛋白對HUVEC細胞增殖的影響Fig.7 Effects of Kal protein on HUVEC cell proliferation.1: normal control; 2: 0.6 μmol/L Kal; 3: 1.5 μmol/L Kal;4: 3 μmol/L Kal; 5: 3 μmol/L endostatin.

圖8 Kal蛋白的抗氧化作用Fig.8 The antioxidation of Kal protein.1: normal control; 2:300 μmol/L H2O2; 3: 300 μmol/L H2O2and 0.6 μmol/L GSH; 4:300 μmol/L H2O2and 0.2 μmol/L Kal; 5: 300 μmol/L H2O2and 0.6 μmol/L Kal.

3 討論

本實驗首次選擇畢赤酵母表達系統，采用廉價的BMMY培養基成功分泌表達Kal蛋白。由于畢赤酵母自身分泌的蛋白成分少，下游純化非常方便，克服了采用大腸桿菌表達量小、表達后需要經過離心收集菌體和超聲破碎細胞才能獲得表達蛋白的缺點，降低了生產成本，且純度也可以達到更高。表達上清經疏水和肝素親和層析即可得到純度達98%的目的蛋白。

本試驗得到的Kal分子量約為58 kDa，與從人血漿中純化得到的Kal蛋白基本吻合，分子量要比大腸桿菌表達的Kal蛋白(40 kDa)大。這種差異可能是由于畢赤酵母表達的Kal蛋白具有一定程度的糖基化。

本試驗初步的活性研究表明 3 μmol/L 重組Kal蛋白對血管內皮細胞的增殖作用與內皮抑素類似[11]，也具有較好的抗氧化活性，與Kal可以抑制H2O2誘導的胞內過氧化物形成的報道一致[12]。

腫瘤生長依賴于血管生成，通過抑制腫瘤血管生成從理論上就能夠餓死腫瘤細胞，并且阻止腫瘤的轉移。研究人員建立了一系列模型對餓死腫瘤的假說進行了驗證，并在實驗基礎上奠定了整個腫瘤新生血管生成的框架。Kal可以抑制腫瘤新生血管的形成[7-8]，Kal不僅可以抑制VEGF或bFGF誘導的體外培養血管內皮細胞的增殖、遷移和粘附，還可以抑制小鼠皮下埋植 Matrigel Plug中經 VEGF或bFGF誘導的毛細血管密度和血紅蛋白含量，是一種極具開發潛力的新型血管生成抑制蛋白，日益受到藥物研究人員的關注。本研究所制備的重組 Kal蛋白能有效抑制血管內皮細胞的增殖，表明其具有抑制腫瘤新生血管形成的能力，而且其活性與已上市藥物內皮抑素基本類似。

腫瘤的發生發展都與體內的氧化系統有關，體內的氧化物質過度積累使細胞膜脂質過氧化而破壞細胞的 DNA而引起腫瘤的產生。實驗證實抗氧化劑對多種腫瘤的生長有抑制作用，對腫瘤細胞凋亡則有促進作用[13]。其機制一方面可能是抗氧化劑封閉自由基在腫瘤細胞增殖中的信號傳導；另一方面是它們通過提高非特異免疫增加了NO的釋放，因此直接抑制腫瘤細胞的增殖[14]。本研究首次報道純化的 Kal蛋白具有過氧化物酶活性，可以抑制H2O2引起的細胞死亡。而Kal的轉基因表達還可以提高eNOS的活性，從而使NO表達水平提高，且能抑制NADPH氧化活性[12]。這也預示Kal的抗氧化作用與其抗炎和抗腫瘤功效密切相關，是有別于單純抗腫瘤新生血管生成藥物的獨特優點，值得深入研究。

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High level expression of recombinant human kallistatin in Pichia pastoris and its bioactivity

Xiaoping Huang1, Xiao Wang1, Hao Dong1, Xiaofeng Zhao1, Zhaofa Li1,2, Qizhao Wang1,2,Ruian Xu1,2, and Yong Diao1,2
1 Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China 2 Molecular Medicine Engineering Research Center of the Ministry of Education, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China

Received:November 3, 2009;Accepted:December 25, 2009

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China(863 Program)(No.2008AA02Z135), National Special Key

Program of China(No.2009ZX09103-643), National Natural Science Foundation of China(No.30973591).

Corresponding author:Yong Diao.Tel/Fax: +86-595-22692516; E-mail: diaoyong@hqu.edu.cn國家高技術研究發展計劃(863計劃)(No.2008AA02Z135)，國家科技重大專項課題(No.2009ZX09103-643)，國家自然科學基金(No.30973591)資助。