海狗油脂肪乳對大鼠圍產期毒性試驗的研究

林飛，于燕，梁懌，周立娜，徐康森

1.中國藥品生物制品檢定所，北京100050

2.西安交通大學醫學院，西安710061

海狗油脂肪乳對大鼠圍產期毒性試驗的研究

林飛1，*，于燕2，梁懌1，周立娜1，徐康森1

1.中國藥品生物制品檢定所，北京100050

2.西安交通大學醫學院，西安710061

觀察了海狗油脂肪乳對大鼠妊娠晚期、分娩期、哺乳期及胚胎和胎仔出生后生長發育、學習能力以及生殖能力的影響.于大鼠妊娠D15至哺乳D21，連續皮下注射給予250、500和1000mg·kg-1劑量的海狗油脂肪乳，同時設0.9%氯化鈉注射液為對照組，觀察各組大鼠和胎仔的生長、發育、生殖能力等項指標.結果表明：給藥后F0代母鼠體重增長明顯減慢，攝食量顯著減少，未見生殖、胚胎毒性反應；F1代仔鼠的出生體重和哺乳期體重增長減慢，生理達標、新生反射等發育遲緩；停藥后F1代大鼠的體重增長、攝食量、臟器系數、同籠交配率、妊娠率及胚胎發育全過程未見明顯生殖、發育等毒性變化.由此結論，海狗油脂肪乳可使母鼠和F1代仔鼠體重增長緩慢，生理發育遲緩，但不影響F1代仔鼠器官發育、生殖能力以及停藥后體重增長和攝食量.

海狗油脂肪乳；大鼠；仔鼠；生長發育；生殖毒性

1 引言（Introduction）

海狗油是從北極海狗中提取的脂肪油，其ω-3多不飽和脂肪酸含量高達80%以上，其中二十碳五稀酸（EPA）、二十二碳五稀酸（DPA）和二十二碳六稀酸（DHA）的含量大于25%，具有降血糖、降血脂、保肝、抗前列腺增生等多種藥理作用（林蘭等，2002;李湛軍等，2003）.而目前臨床應用于危重癥患者、手術后或需要腸外營養劑病人的脂肪乳，主要從大豆油或魚油中提取，是腸外營養時人體的重要能量來源，還可以提供必須脂肪酸，具有廣泛地生物活性（江華等，2007）.將海狗油制備成脂肪乳，改變臨床用藥途徑后，更有利于人體的吸收和代謝；但藥物直接注射進入體內，失去了胃腸道屏障作用，對人體的安全性需要高度關注.前期研究表明，海狗油脂肪乳無致突變作用（林飛等，2008）、無大鼠致畸胎作用（李華等，2008），本研究進一步探討了其對大鼠圍產期的毒性作用.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 材料

2.1.1 受試藥物

海狗油脂肪乳（Seal Oil Emulsion,SOE）為乳白色等滲液體，溶于水，濃度為30%，由中國生化制藥協會海狗油應用專業委員會提供，批號20051110，4℃避光、密閉保存.試驗前吸取30%海狗油脂肪乳60mL，加入0.9%氯化鈉注射液（NS）30mL進行混懸并稀釋至90mL，制成20%的濃度作為高劑量組；取20%海狗油脂肪乳30mL加NS 30mL稀釋成10%的濃度作為中劑量組；取10%海狗油脂肪乳20mL加NS 20mL稀釋成5%的濃度作為低劑量組，大鼠皮下注射（SC）給藥容積為每100g體重0.5mL.

2.1.2 對照品

溶劑對照為0.9%氯化鈉注射液（NS），每瓶500mL，批號0602115，由北京雙鶴藥業有限公司生產.

2.1.3 實驗動物

選用中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供的SPF級SD種大白鼠雌性90只、雄性45只，體重250～280g，許可證號：SYXK（京）2006-0004號，大鼠按性別分籠，每籠5只，飼養觀察1周后用于試驗.

2.1.4 實驗動物室

三級標準，全密閉狀態，三級過濾送風，溫度22℃～24℃，相對濕度40%～45%，日光燈12h照明.高壓滅菌木刨花屑為墊料.塑料鼠盒體積35cm×30cm×18cm，不銹鋼絲頂蓋.SPF級大鼠繁殖顆粒飼料和去離子水均由中國藥品生物制品檢定所實驗動物中心提供.

2.2 實驗方法

實驗方法參考文獻（周海鈞，2001;袁伯俊和王治喬，1997;國家食品藥品監督管理局，2006）.

2.2.1 實驗分組

試驗設有3個海狗油脂肪乳劑量組，高劑量組為1000mg·kg-1，中劑量組500mg·kg-1，低劑量組250mg·kg-1（以大鼠體重計）和等體積溶劑對照組（NS）.

2.2.2 給藥時間

每只妊娠鼠受孕的第15d至哺乳期第21d結束，每日SC給藥1次，連續給藥28d.每日根據大鼠體重增長情況增加給藥體積.

2.2.3 同籠交配

將大鼠按雄:雌=2:1同籠交配，連續10d（2個性周期）.每天上、下午進行陰道涂片檢查，將顯微鏡下觀察到精子的雌鼠確定為交配鼠，并作為妊娠0d.交配鼠按體重隨機分到各組合籠飼養，每籠3～5只，每組交配鼠≥20只.

2.2.4 觀察指標

a.一般表現：每日SC給藥的同時觀察每只妊娠鼠和哺乳鼠的精神、行為、活動、毛色、眼、鼻分泌物、糞便、分娩時間及哺乳狀態等.

b.稱重：在妊娠期第0、6、10、15、18、20d和分娩后的1、7、14和21d稱取每只F0代大鼠體重.哺乳期第1、7、14和21d稱取每只F1代仔鼠體重.選擇F1代仔鼠雌、雄各10只在出生后第4～10周齡，每周稱取一次體重.在妊娠期第0、6、10、15、18和20d稱取F1代妊娠鼠體重.

c.攝食量：F0代大鼠在整個妊娠期和哺乳期每周測定一次攝食量；F1代大鼠雌、雄各10只在出生后的第4～10周齡每周測定一次攝食量.

d.計數：每窩胎仔總數、活胎數、死胎數、外觀畸形胎數、出生存活率、哺乳期存活率.

e.定員：每窩盡可能保留4對體形健壯的仔鼠，多余仔鼠去除，不足8只仔鼠的補充（補充的仔鼠考慮性別，必須在哺乳母鼠的糞便中翻滾數次，母鼠口、鼻處涂抹異味劑，防止咬食非親生乳鼠）

f.生理發育：每窩全部仔鼠在生長期觀察耳廓分離、上門齒萌出、開眼、出毛、外耳道張開、睪丸下降和陰道張開等達標日齡的組織器官發育.

g.新生反射：每窩全部仔鼠在生長期觀察仔鼠平面翻正、懸崖回避、負趨地性、行走和空中翻正等達標日齡的神經反射發育.

h.學習能力及神經行為：每窩6只仔鼠在出生28日齡時，進行游泳試驗和暗室電擊試驗.

i.內臟檢查：進行游泳及暗室電擊試驗后，每窩處死F1代仔鼠雄、雌各2只，解剖后觀察內臟器官是否存在異常變化，剪取心、肝、脾、肺、腎、睪丸連附睪、子宮連卵巢和腦等臟器并稱重，計算臟器系數.

j.生殖行為和胚胎毒性：每窩保留28日齡的F1代仔鼠雌、雄各1只，每組保留共20只，分籠喂養到出生第10周后，以雌:雄=1:1同籠交配1周，觀察交配率和妊娠率.在妊娠第20日處死F1代母鼠，檢查黃體數、著床數、活胎數、死胎數、吸收胎數、體表畸形胎數、胎仔體重和性別.

2.3 數據處理

數據用平均值±標準差（x±s）表示，采用SPSS 11.0進行方差分析和X2檢驗.

3 結果（Results）

3.1 F0代妊娠鼠

3.1.1 一般情況

給藥期間溶劑對照組和給藥各劑量組每只妊娠鼠的精神好、行為正常、活動自如、被毛潤澤、眼、鼻無分泌物和血跡、無稀便等.

3.1.2 體重及攝食

海狗油脂肪乳對F0代雌性大鼠妊娠期和哺乳期體重增長和攝食量的影響如表1、表2所示.妊娠末期中、高劑量組體重增長緩慢；哺乳期大鼠體重增長緩慢更加明顯，與溶劑對照組比較，統計學分析具有極顯著性差異（p＜0.01）.妊娠末期及哺乳期給藥各劑量組的大鼠攝食量顯著減少，與溶劑對照組比較，統計學分析具有極顯著性差異（p＜0.01）.

表1 海狗油脂肪乳對F0代雌性大鼠妊娠期和哺乳期體重增長的影響（x±s.g）Table 1The effects of Seal Oil Emulsion in different period on the weight gain of F0rats（x±s,g）

表2 海狗油脂肪乳對F0代雌性大鼠妊娠期和哺乳期攝食量的影響（x±s,g/100g）Table 2The effects of Seal Oil Emulsion on the appetite of F0rats（x±s,g/100g）

3.1.3 分娩與哺乳

溶劑對照組和給藥各劑量組妊娠鼠未見流產，其分娩時間均在妊娠第21～22日；窩產仔鼠數在7～15只；哺乳期間未見拒絕哺乳和攻擊乳鼠等現象出現.

3.2 F1代仔鼠

3.2.1 產仔數和存活率

溶劑對照組和給藥各劑量組的胎仔總數、活胎數、死胎數、外觀畸形胎數和出生存活率均未見異常.高劑量組的胎仔體重（5.3±0.4）g和哺乳期存活率（93.7%）出現數值降低，與溶劑對照組（（5.7±0.3）g；97.9%）比較，統計學分析具有顯著性差異（p＜0.05）.

3.2.2 仔鼠體重

海狗油脂肪乳對F1代仔鼠體重增長的影響如表3所示.給藥中、高劑量組在不同的哺乳期出現體重增長緩慢，與溶劑對照組比較，統計學分析具有顯著性差異或極顯著性差異（p＜0.05或＜0.01）.各組隨機保留的雌、雄各10只仔鼠，在離乳后至性成熟的7周時間中，給藥各劑量組的大鼠隨著脫離藥物的時間延長，體重增長和攝食飼料量逐漸恢復正常，與溶劑對照組比較，僅在離乳中、晚期之前統計學分析具有顯著性差異或極顯著性差異（p＜0.05或＜0.01）.

表3 海狗油脂肪乳對F1代仔鼠體重增長的影響（x±s,g）Table 3The effects of Seal Oil Emulsion on the body weight gain of F1rats（x±s,g）

3.2.3 生理發育

海狗油脂肪乳對F1代大鼠生理標志達標日齡的影響如表4所示.給藥中、高劑量組的門齒萌出、睪丸下降和陰道張開達標日齡明顯推遲，與溶劑對照組比較，統計學分析具有顯著性差異或極顯著性差異（p＜0.05或＜0.01）.

表4 海狗油脂肪乳對F1代大鼠生理標志達標日齡的影響（x±s,d）Table 4The effects of Seal Oil Emulsion on the physiological indexes of F1rats（x±s,d）

3.2.4 新生反射

海狗油脂肪乳對F1代大鼠新生反射達標日齡的影響如表5所示.給藥中劑量組的平面翻正達標日齡、高劑量組的平面翻正和空中翻正達標日齡明顯推遲，與溶劑對照組比較，統計學分析具有極顯著性差異（p＜0.01）.

3.2.5 學習能力及神經行為測試

海狗油脂肪乳對F1代仔鼠學習能力的影響如表6所示.給藥高劑量組的仔鼠空間定位建立時間增加不明顯，仔鼠逃離水患潛伏期的時間明顯延長，與溶劑對照組比較，統計學分析具有極顯著性差異（p＜0.01）.給藥高劑量組暗室電擊條件反射建立時間明顯延長，建立記憶次數明顯增加，與溶劑對照組比較，統計學分析具有顯著性差異或極顯著性差異（p＜0.05或＜0.01）.

表5 海狗油脂肪乳對F1代大鼠新生反射達標日齡的影響（x±s,d）Table 5The effects of Seal Oil Emulsion on the neonatal reflexes of F1rats（x±s,d）

表6 海狗油脂肪乳對F1代仔鼠學習能力的影響（x±s）Table 6The effects of Seal Oil Emulsion on the ability of learning of F1rats（x±s）

3.2.6 臟器檢查及稱重

哺乳期結束后，解剖仔鼠未發現內臟器官發育不全或畸形.給藥各劑量組的心、肝、脾、肺、腎、睪丸、附睪、子宮、卵巢和腦等各臟器系數值基本一致，與溶劑對照組比較，統計學分析未見顯著性差異（p＞0.05）.

3.2.7 妊娠鼠體重增長

妊娠期間體重增長明顯，各組大鼠體重增長值基本一致，與溶劑對照組比較，統計學分析未見顯著性差異（p＞0.05）.另外未發現大鼠在妊娠中、后期出現流產和死亡.

3.2.8 生殖行為和胚胎毒性

給藥各劑量組的出生第11周齡大鼠性沖動（追逐、嘶咬、爬背和性交等）和性周期（陰道涂片鏡檢）基本正常，同籠交配率和妊娠率基本一致；胚胎的黃體數、著床數、活胎數、死胎數、吸收胎數、胎仔體重和性別等均無明顯變化，與溶劑對照組比較，統計學分析未見顯著性差異（p＞0.05）.

4 討論（Discussion）

脂肪乳從上個世紀60年代開始應用于外科及危重病人的營養支持.第一代脂肪乳是以大豆油為基礎原料，富含ω-6脂肪酸的亞油酸，該亞油酸過多攝入可出現某些生理失調、中樞神經系統紊亂、過敏反應和多種臟器器官的損害等（喻濤等，2007）.而魚油中存在的ω-3多不飽和脂肪酸除對人體具有更多的生物活性作用外，還有減少上述毒副反應的作用（于健春和郭衛東，2006）；海狗油含有的ω-3多不飽和脂肪酸更多，藥理作用更廣泛，臨床治療和預防的前景更大.

圍產期毒性試驗是近年來我國與國際接軌，對創新藥所要求的必做項目，國內文獻在受試藥品的劑量設計、動物數量、試驗指標設定、觀察內容和數據統計方法等差別較大（林飛等，2007;方鋁等，2004;曹采蘋等，1997）.為了規范試驗方法，國家食品藥品監督管理局參照《藥品注冊的國際技術要求（ICH）》（周海鈞，2001），制訂了我國的《藥物生殖毒性研究技術指導原則》，該指導原則的實施將規范試驗方法，促使圍產期毒性試驗的發展和提高.圍產期毒性試驗所要求的試驗項目較多，雖然各實驗室在每個項目中選擇的試驗指標有所不同，但以能夠觀察確定不同時期、不同生長發育階段動物的毒性反應即可，不做具體的要求（國家食品藥品監督管理局，2006）.

母鼠分娩的仔鼠數一般在8～14只，個別母鼠分娩的仔鼠數少則1、2只或多則16只以上.如果窩仔鼠數差別過大，勢必影響母鼠的喂養質量（孫靖，2005），乳汁不足，母鼠消瘦，胎仔生長發育緩慢等.為了減少窩仔鼠的數量差異所造成的組內數值差異過大，影響組間的統計學分析和判定，選擇窩仔鼠數8只，多余仔鼠剔除，不足仔鼠補充（異窩仔鼠需在哺乳母鼠的糞便中反復滾動，哺乳母鼠的口鼻涂抹異味劑，以防攻擊仔鼠），使組內數值差異縮小，組間比較更容易發現毒性反應.

海狗油脂肪乳可使給藥各劑量組F0代大鼠妊娠后期及哺乳期體重增長明顯降低，攝食量顯著減少和胎仔體重減輕；對給藥各劑量組F1代仔鼠的出生體重、哺乳期體重和離乳后體重均出現增長緩慢；對生理發育、新生反射、學習能力及神經行為等出現發育遲緩；但對給藥各劑量組F0代雌性大鼠的分娩時間、窩產仔數、活胎仔數、死胎仔數、體表畸形胎仔數和胎仔出生存活率等未見毒性反應；對給藥各劑量組F1代大鼠的臟器系數值和妊娠鼠體重增長等未見明顯變化；對給藥各劑量組F1代性成熟大鼠的同籠交配率、妊娠率及胚胎發育全過程等未見明顯生殖、發育等毒性反應.

本研究提示：海狗油脂肪乳可使F0代妊娠鼠攝食量減少、體重增長緩慢，由此出現乳汁相對減少或藥物通過乳汁作用于F1代仔鼠，出現仔鼠在哺乳期和離乳期的體重增長緩慢，出生后生長發育、學習能力及神經行為等發育滯后等.但對F0代雌性大鼠的分娩時間、胚胎發育和胎仔出生存活率等未見毒性反應；對F1代大鼠的內臟器官的發育、性成熟時間、同籠交配率、妊娠率、妊娠鼠體重增長及胚胎發育等未見明顯生殖、發育等毒性反應.

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The Toxic Effects of Seal Oil Emulsion on Rats during Perinatal Period

LIN Fei1，*，YU Yan2，LIANG Yi1，ZHOU Li-na1，XU Kang-sen1

1.National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050
2.Department of Public Health,College of Medicine of Xi’an Jiaotong University Xi’an 710061

In order to observe the toxic effects of Seal Oil Emulsion on the maternal rat in late trimester of pregnancy,the growth and development,and the abilities of learning and procreation of the offsprings,SD pregnant rats were given Seal Oil Emulsion orally from gestational day 15 to weaning day 21.The experimental groups

250、500 and 1000mg·kg-1of Seal Oil Emulsion.Results showed that the body weight accretion and appetite of maternal rat（F0）in experimental groups was significantly lower than that in negative control group（p＜0.05）.The body-weight of the offsprings（F1）at birth and accretion during lactation were significantly decreased（p＜0.05）.The physiological indexes and neonatal reflexes were delayed significantly（p＜0.05）.But there were no toxic effects on the body weight gain,appetite,visceral measurements,mating ratio,pregnancy ratio and fetal development on stopping drugadministration.It was indicated that among the range used,Seal Oil Emulsion caused obvious body weight accretion in F0and F1,and developmental delay.But there were no the toxic effects on the visceral development,reproductive ability,body weight increase,and appetite on stopping the drug.

Seal Oil Emulsion；rat；fetus；development；reproductive toxicity

20 March 2009accepted17 August 2009

1673-5897（2010）1-105-07

R965.3

A

2009-03-20錄用日期：2009-08-17

林飛（1954—），研究員；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:linfeibj@yahoo.com.cn

林飛（1954—），研究員，主要從事藥品、保健食品的安全性研究.