大鼠胚胎期PFOS暴露致出生早期死亡及神經系統發育影響的基因組學分析

王法琦，劉薇，金一和，*，于文廣，劉曉暉，劉力

1.大連理工大學環境與生命學院，大連160024

2.中國醫科大學公共衛生學院，沈陽110001

大鼠胚胎期PFOS暴露致出生早期死亡及神經系統發育影響的基因組學分析

王法琦1，劉薇1，金一和1，*，于文廣1，劉曉暉1，劉力2

1.大連理工大學環境與生命學院，大連160024

2.中國醫科大學公共衛生學院，沈陽110001

為了闡明PFOS導致新生兒死亡的可能原因和機制，探討PFOS致死與神經系統發育的相互聯系，利用基因芯片技術，觀察了經PFOS飼料染毒后出生1和7d大鼠腦組織基因表達情況，通過基因組學（Gene Ontology）和生物路徑（Pathway）對差異基因的功能和相互聯系進行分析.結果顯示，PFOS染毒后，出生1、7d的大鼠腦皮質組織分別有864、642條基因發生差異表達，差異基因涉及的與PFOS致死相關的生物過程包括中樞神經系統發育、血循環系統、刺激應答、骨骼發育、氧化應激、心臟功能以及pH值調節等.結果表明，PFOS導致的出生早期死亡與神經系統發育有關，PFOS可能通過改變腦組織血氧平衡，影響正常的中樞神經系統功能和發育過程而使新生兒的存活率下降.

全氟辛烷磺酸；出生早期死亡；基因芯片；發育神經毒性

1 引言（Introduction）

全氟辛烷磺酸（Perfluorooctanesulfonate,PFOS）是全氟有機化合物（Perfluorinated compounds,PFCs）家族中的代表性化合物之一，也是含氟系列產品經過化學或生物降解的最終產物（Calafat et al.,2006）.近年的研究表明PFOS廣泛存在于自然環境、動物和人體內.PFOS被動物攝入體內后，大部分與血漿蛋白結合存在于血液中，其余一部分蓄積在動物的肝臟組織和肌肉組織當中，并能通過胎盤屏障，直接作用于胎兒（Smithwick et al.,2005）.由于PFOS化學性質穩定、揮發性弱，一直以來被認為是毒性較低的化學物質并沿用至今，但最近的毒理學研究表明它具有肝臟毒性、神經毒性、心血管毒性、胚胎發育與生殖毒性、遺傳毒性與致癌性、免疫毒性等多重毒性效應（胡存麗和仲來福，2006），是一種全身毒性化合物.目前PFOS已被列入美國環保局持久性環境污染物黑名單（Calafat et al.,2006）.

近來有關PFOS胚胎期暴露致使出生早期死亡率增高的研究越來越受到人們的關注（Lau et al.,2003;Johansson et al.,2008;Shi et al.,2008;Luebker et al.,2005b;Austin et al.,2003）.Abbott等人（2009）通過比較研究孕期PFOS暴露后過氧化物酶增殖物激活受體α（Peroxisome proliferatoractivated receptor α,PPARα）缺陷型和野生型幼鼠的死亡率，發現PFOS致死與PPARα無關.同樣地，PFOS誘導的新生兒死亡也與脂質代謝異常和體內甲狀腺激素紊亂無關（Luebker et al.,2005b），而可能由顱內出血以及胚胎期呼吸系統和肺功能發育障礙導致的（Borg et al.,2009;Grasty et al.,2003;Yahia et al.,2008）.PFOS能透過胎盤屏障和血腦屏障，損害發育期生物體的中樞神經系統（Fuentes et al.,2006;Butenhoff et al.,2009）.許多研究表明PFOS能引起發育神經毒性（Lau et al.,2003;Johanssonetal.,2008;Shietal.,2008;Luebkeretal.,2005b;Austinetal.,2003;Butenhoff et al.,2009;劉利等，2009），并且PFOS已被認為是一種神經毒劑（Austin et al.,2003），可能通過改變神經發育及干擾神經內分泌系統而發揮毒性效應（Slotkin et al.,2008）.研究顯示，神經系統早期發育異常與嬰幼兒的死亡密切相關（Luebker et al.,2005b）.因此PFOS引起新生兒死亡可能與其導致的神經發育異常密切相關.

為了研究孕期PFOS暴露導致新生鼠死亡的原因，探討PFOS致死與發育神經毒性的相互關系，本文利用基因芯片技術從分子水平研究了PFOS導致新生鼠死亡的可能原因與機制，以及神經系統發育在PFOS致死過程中的作用，力求找出潛在的引起PFOS致死的神經功能變化.由于PFOS胚胎期暴露更容易誘導新生兒死亡（Du et al.,2009），并且胚胎發育晚期是PFOS致死的關鍵時期（Luebker et al.,2005b），本文選取PFOS孕期染毒模式，研究出生后第1、7d大鼠的基因表達情況，通過對PFOS誘導的差異表達基因進行生物路徑和分子功能分析，得出與PFOS致死相關的所有可能分子機制，從這些機制或路徑中找出與神經發育相關的功能變化，從而闡明PFOS導致新生鼠死亡與神經系統發育之間的潛在聯系.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 試劑

全氟辛烷磺酸鉀K+PFOS（C8F17KO3S;No.2795-39-3;純度>98%）購自Fluka化學試劑公司.K+PFOS的溶劑為2%的吐溫R20.將配制成的1.6mg·mL-1PFOS鉀鹽溶液充分混勻于粉末狀飼料中，分別制成濃度為0、3.2mg·kg-1飼料的兩種粉狀飼料，對照組只加入2%吐溫溶液.染毒前利用液相色譜-質譜（LC-MS/MS）檢測染毒飼料中PFOS含量以確保每份飼料的均勻度和有效性.

2.2 試驗動物及染毒

Wistar雄性大鼠（250～300g）及雌性大鼠（180～200g）購自大連醫科大學實驗動物中心.動物室溫度18～23℃，相對濕度45%～55%.實驗期間動物自由飲水、攝食.實驗前馴養1周后，將大鼠按3:1的雌、雄比例合籠，次日早晨陰道涂片，以陰道鏡檢檢出精子為母鼠妊娠第1天.將孕鼠隨機分為對照組和PFOS（3.2mg·kg-1（飼料））染毒組.實驗過程中剔除假孕母鼠.飼料放置于自制飼料盒中，大鼠以舔食方式攝取食物.各實驗組母鼠通過自由攝食攝入至實驗結束.

2.3 動物處理方式

分別取出生后第1、7d仔鼠，斷頭處死，冰上快速取腦，分離出大腦前額外層皮質，所有采集樣品均保存于液氮中備用.

2.4 腦組織RNA提取

從液氮中取出腦皮質（100mg左右）在液氮中研磨，腦皮質RNA的提取過程按照試劑盒說明書操作（Takara）.利用瓊脂糖凝膠電泳，比較28S與18SRNA熒光度以確定RNA的完整性；利用紫外分光光度法測定RNA在A260、A280及A320的吸光度來確定RNA的純度和估測濃度.從每個劑量組隨機取出6個RNA樣品（雌雄各半）平均混合后進行基因芯片分析.

2.5 基因表達測定

采用Illumina全基因組表達譜芯片（Illumina,San Diego,CA,USA）分別檢測出生第1、7d大鼠腦皮質基因表達變化.本芯片包含來自NCBI數據庫的共22228個轉錄本（Release 16;Illumina,San Diego,CA,USA），總RNA的純化利用QIAGEN RNeasy Mini Kit（Illumina,San Diego,CA,USA）.第一鏈和第二鏈cDNA合成以及Biotin標記cRNA的體外合成、純化由IlluminaRTotalPrepTM RNA Amplification Kit（AMIL1781,Ambion Inc.）完成.探針雜交條件為58℃下18.5h，按Illumina雜交體系要求對芯片進行清洗和浸染.信號值由Cy3染料讀出，使用雙通道，0.8μm高分辨率的共聚焦激光掃描儀（Illumina）對磁珠芯片進行掃描測定.

2.6 差異表達基因分析

將輸出的信號值輸入BeadStudio-3（Illumina）分析軟件進一步分析，利用Cubic Spline Algorithm對數據進行歸一化處理，采用Algorithm of the Illumina Custom對染毒組和對照組數據進行成對比較以確定PFOS染毒后差異表達的基因.差異表達基因信息包括：信號平均值（AVG_Signal，每個基因所對應的平均熒光信號值），檢出P值（Detection Pval，一般≤0.01認為該基因被檢出），差異分數（DiffScore,一般≥13或≤－13判定為具有統計學顯著性差異），差異P值（DIFF Pval,一般＜0.05相當于DiffScore≥13或≤－13）.

2.7 芯片數據的Gene Ontology（GO）和Pathway分析

利用網絡分析工具（http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm）對基因芯片的原始數據進行生物功能（GO）和相關生物路徑（Pathway）分析以便得到差異表達基因所涉及的生物學效應以及各個差異表達基因在執行相應生理功能時的相互聯系.

根據新生兒早期死亡的相關生物因素或過程（http://en.wikipedia.org/wiki/Perinatalmortality），找出芯片分析結果中與PFOS致死相關的生物過程.

2.8 基因芯片數據驗證

利用實時半定量RT-PCR技術隨機選取出生后第1、7d均發生變化的7個差異表達基因進行反轉錄PCR試驗，以驗證芯片試驗的有效性和可信性.

3 結果與分析（Results and analysis）

3.1 PFOS對出生1、7d大鼠腦皮質基因表達的影響

3.1.1 差異表達基因

染毒組仔鼠在出生后第1、7d分別有842和634個基因與對照組比較發生顯著性變化（p＜0.05），出生1、7d均發生變化的基因為122個.出生后1、7d上調表達的基因分別為464和359個；出生后1、7d下調表達的基因分別為378和275個；24個基因在出生后1、7d均表現為上調表達，11個基因在出生后1、7d均下調表達；62個基因在出生后1d上調表達，出生后7d下調表達，25個基因在出生后1d上調表達，出生后7d下調表達（圖1）.應用RT-PCR技術對芯片結果進行驗證，結果表明約80%的基因在兩種技術中顯示一致的表達結果（表1、表2）.

圖1 孕期PFOS暴露對出生后1、7d大鼠腦皮質差異表達基因數的影響Fig.1Effect of gestational PFOS exposure on the numbers of differentially expressed genes at PNDs 1 and 7

表1 RT-PCR驗證基因序列Table 1Information on prime sequences of genes for RT-PCR

3.1.2 差異表達基因相關生物功能和路徑

通過GO分析，發現差異表達基因所涉及的生物過程（Bioprocess）包括電子離子轉運、脂質代謝、激素調節和氧化應激等與以往報道的結果一致（Shi et al.,2008;Yeung et al.,2007;Kr?vel et al.,2008）；本研究發現的與神經發育相關的生物過程包括中樞神經系統發育、神經發生、記憶、神經遞質傳遞和突觸可塑性等（圖2）.這些差異表達基因在各自生命活動中的相互聯系與作用可由它們所涉及的生物路徑（Pathway）表示，出生1、7d顯著性變化的生物路徑主要有細胞分裂、細胞通信、鈣離子信號轉導、長時程增強或抑制以及PPAR信號轉導路徑等（表3）.

表2 驗證基因的RT-PCR結果和基因芯片結果比較Table 2Validation of differentially expressed genes（DEGs）determined by Beadchips with RT-PCR

圖2 出生1、7d大鼠腦差異表達基因相關的神經系統生物過程（Bioprocess,BP）（PV指芯片結果中某一生物過程相關的差異基因數與此項生物過程所涉及的總基因數的百分比）Fig.2Neuro-bioprocesses（BP）associated with differentially expressed brain genes in rat at PNDs 1 and 7（PV means percentage value of input related genes from microarrays to total related genes for a category）

表3 孕期PFOS暴露引起出生1、7d大鼠腦差異表達基因的相關生物路徑分析（Pathways）Table 3Analysis of pathways associated with genes differentially changed at PND1 and PND7 by gestational PFOS exposure

3.2 PFOS致死相關生物過程.

根據新生動物早期死亡相關的生物因素（http://en.wikipedia.org/wiki/Perinatal mortality），找出芯片數據中的PFOS顯著影響的致死相關生物過程包括直接致死過程（death）、中樞神經系統發育、刺激反應、呼吸系統、血液循環體系、骨骼發育、體內活性氧反應、心肺功能以及體內pH值調節等（表4）.

4 討論（Discussion）

本文首次利用高通量的基因芯片技術，從分子水平闡釋PFOS引起新生兒死亡的可能原因，尤其是神經系統發育在PFOS致死過程中的作用.PFOS具有發育神經毒性已被證實，并且對發育過程中神經系統的影響大多伴隨著神經行為和存活率的改變.孕鼠暴露于PFOS可導致受試動物出生致死率升高，并具有劑量依賴性，而存活的幼鼠出現生長遲緩、低甲狀腺素血癥和甘油三脂水平下降等現象（Lau et al.,2003;Yu et al.,2009）.Johansson等（2008）研究了PFOS對新生小鼠神經行為的影響，發現PFOS能使小鼠的存活率降低，自發行為紊亂，膽堿能系統異常.Shi等（2008）對斑馬魚卵進行PFOS染毒，發現魚仔孵化率和幼魚存活率顯著降低，存活幼魚表現出不同程度的發育畸形；某些與細胞調亡和甲狀腺發育的相關基因表達顯著變化，并推測胚胎期的基因表達模式是影響PFOS致死毒性的潛在機制.Luebker等（2005a）對SD母鼠孕期染毒，發現出生后5d仔鼠的存活力降低，相應母鼠的孕期減少.Luebker等（2005b）研究了PFOS對大鼠兩代仔鼠各種行為指標的影響，結果顯示3.2mg·kg-1·d-1染毒組F1代仔鼠在出生后1～4d內全部死亡，1.6mg·kg-1·d-1劑量組在F1代仔鼠斷乳期時出現存活率降低的現象，而其它較低劑量組PFOS引起了包括睜眼（eye opening）、順毛（air rigting）、張耳（pinna unfolding）等發育行為的遲緩，提示PFOS對大鼠胚胎期暴露直接影響新生仔鼠的存活率.此外，PFOS可以通過血腦屏障直接作用于中樞神經系統（Austin et al.,2003）.神經系統發育障礙與腦相關疾病能夠導致嬰幼兒死亡.Dutra等（2007）研究了

出生6d內的羔羊的存活率與神經系統損傷的關系，將死亡羔羊解剖后發現，尸體出現不同程度的腦充血和水腫、神經元缺血性壞死以及多處腦區溢血等癥狀，提出神經系統損傷可能會解釋大多數新生或出生6d內的死亡現象.另外，流行病學資料顯示多種神經系統疾病也參與了機體的死亡過程（Dutra et al.,2007），如神經系統綜合癥能導致死亡率增高（Wilson et al.,1978）；老年癡呆（阿耳茨海默氏病，Alzheimer’s disease）癥能加劇死亡的發生（White et al.,1998），而本研究結果還表明這種病顯著受孕期PFOS暴露的影響（表3），因此，在研究PFOS致死原因與機制時，不能忽視發育期神經系統的毒性反應對PFOS致死的影響.本研究中，出生1、7d染毒組大鼠腦皮質的差異表達基因數從864降為643，說明出生早期大鼠的神經系統更容易受到PFOS影響，而PFOS胚胎期暴露對出生早期動物的存活率影響更大（Luebker et al.,2005b;Du et al.,2009;Yahia et al.,2008），說明出生存活率和神經系統發育在同一時期更易受到PFOS影響，提示PFOS對神經系統發育的影響可能與PFOS致死相關.有報道顯示，PFOS導致新生兒死亡可能是由顱內血液循環不良造成（Yahia et al.,2008），而腦損傷所導致的死亡與神經系統的血液循環異常有關（Haughey,1973）.本研究也得到了類似的結果（表4），出生1、7d大鼠中與中樞神經系統發育相關的差異基因數分別為17、20；與血液循環、血管發育、血管張力調節、血管形態發生等血循環系統相關的基因數均為29；與缺氧反應相關基因數分別為10、8，而且所用試驗樣本為支撐腦組織脈絡叢的大腦外層皮質，提示PFOS可能通過影響心血管系統的發生發育和成熟，改變腦組織血氧平衡，影響中樞神經系統正常功能和發育過程從而導致新生兒死亡率增高.

表4 孕期PFOS暴露引起出生1、7d大鼠腦差異表達基因的相關致死生物過程Table 4The differentially expressed brain genes related bioprocesses associated with gestational PFOS-induced mortality at PNDs 1 and 7

此外，研究結果還顯示（表4），出生1d與呼吸系統相關的PFOS可能致死因素為肺發育與呼吸管發育，每項各有5個差異基因參與；出生7d與呼吸系統相關的可能致死因素為呼吸系統過程和呼吸氣流交換，每項各有2個差異基因參與.這與以往研究的PFOS引起的肺功能障礙（Luebker et al.,2005b;Yahia et al.,2008），以及肺發育紊亂（Grasty et al.,2005）可能是PFOS致死原因的報道一致.而且，PFOS對呼吸系統的影響在不同的發育期表現不同，數據顯示PFOS剛出生時更容易影響發育過程，這可能是由于肺發育主要發生在胚胎晚期（Grasty et al.,2003），而出生7d后則傾向于影響呼吸功能.除此之外，PFOS涉及的一些可能致死因素還包括刺激應答、骨骼發育、氧化應激、心臟功能、pH值調節等生理生化過程.這些功能系統改變也可能單獨地或者相互地參與了PFOS的致死過程.

總之，本文利用分子學手段研究了PFOS致死敏感期的差異基因表達情況，為進一步研究PFOS致死原因和機制提供了大量的參考信息，并特別提出了神經系統發育可能在PFOS致死過程中發揮關鍵作用.下一步的研究將從與PFOS致死相關的差異表達基因著手，研究它們編碼蛋白的表達差異以及相應的生理生化反應變化，從而進一步補充PFOS引起新生兒死亡的生物機制.

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Genomic Analysis of Effects of Gestational PFOS Exposure on Neonatal Death and the Nervous System Development in Rat

WANG Fa-qi1，LIU Wei1，JIN Yi-he1，*，YU Wen-guang1，LIU Xiao-hui1，LIU Li2

1.School of Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024
2.School of Public Health,China Medical University,Shenyang 110001

To investigate the potential mechanism of PFOS-induced neonatal mortality at the molecular level and to find out the interaction between PFOS-induced mortality and developmental neurotoxicity,the RatRef-12 Expression BeadChip was used to identify changes in gene expression at postnatal days（PNDs）1 and 7.The Gene Ontology for translation genes into relative functions and the pathway for graphical representations of gene interactions were both employed for further analysis of the expression data.There are 864 and 642 genes significantly affected by PFOS at PNDs1 and 7,respectively（p＜0.05）.Some of bioprocesses related to differentially expressed genes have been involved in the PFOS-induced mortality including:death,the central nervous system development,blood circulation,response to stimulus,bone development,response to hypoxia,heart process and regulation of pH.Results of this study indicate that the disruption of nervous system may lead to PFOS-induced neonatal mortality through the disruption of the brain blood and oxygen system and interference with the normal functional process of brain.

perfluorooctane sulfonate；neonatal mortality；genechip；developmental neurotoxicity

10 March 2010accepted25 March 2010

1673-5897（2010）2-176-08

X171.5

A

2010-03-10錄用日期：2010-03-25

國家自然科學基金項目（No.30771772）

王法琦（1982—），女，博士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:jinyihe@dlut.edu.cn

金一和（1959—），男，教授，博士生導師.從事環境毒理學研究.1990年7月日本秋田大學醫學部畢業，現任日本毒理學會海外評議員、中國氣象學會大氣成分委員會委員，兼任《中華預防醫學雜志》、《衛生研究》和《國外醫學》（衛生學分冊）等期刊編委.