肺癌組織中miR-125b-1基因的突變及其臨床意義

霍學云，蘇 琳，鄭永明

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，如今由肺癌及其轉移瘤所致的病死率已占癌癥病死率之首。盡早發現、診斷及治療是降低肺癌病死率的有效途徑，而要做到早發現、早診斷、早治療就必須明確其發生、發展及轉移機制。肺癌的形成是一個多階段、多步驟的復雜過程。微小 RNA（microRNAs，miRNA)與腫瘤的發生明顯相關[1]，在人類腫瘤中miRNA的表達水平異?；虬l生突變[2]。miR-125b-1定位于11q23-24雜合型缺失（LOH）的微小區域，這一區域在肺部腫瘤、乳腺癌和卵巢癌中存在突變或缺失[3]，提示其可能與肺癌的發生相關。目前對miRNA與腫瘤關系的研究中，通常只是鑒定miRNA的表達豐度，其核苷酸序列是否突變尚無報道。為了從DNA水平研究miR-125b-1基因異常與肺癌發生的關系，筆者應用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性 （PCRSSCP）分析方法檢測人肺癌組織miR-125b-1基因的突變情況，并分析了其與肺癌患者臨床病理生理特征和預后的關系?，F將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 119例肺癌組織標本取自筆者所在醫院病理科存檔的2004-06～2006-10的組織蠟塊。其中男92例，女27例；年齡30～76歲，平均（56±12）歲。每例均有詳細的臨床資料和手術記錄，所有患者術前均未進行任何抗腫瘤治療。按照WHO標準（1999年第3版）進行組織學分類，鱗癌50例，腺癌51例，大細胞癌9例，小細胞癌9例；按國際抗癌聯盟 (UICC，1997年第5版)TNM分期，T1期 34例，T2期 61例，T3期 22例，T4期 2例；N0期54例，N1期30例，N2期 31例，N3期 4例。另取同期手術的肺良性病變肺組織42例作對照，其中男28例，女 14 例；年齡 10～60 歲，平均（39±10）歲；支氣管擴張14例，肺結核瘤13例，炎性假瘤11例，肺膿腫4例。

1.2 患者隨訪資料 以門診、電話、隨訪信形式對119例試驗組患者進行隨訪,隨訪時間至2007-05，有隨訪結果的有94例，失訪25例。94例中，死亡人數(直接死于肺癌的患者)為63例，截尾人數（失訪、死于其它原因或持續生存至本文總結時）為31例，中位生存期是41個月。

1.3 模板DNA的提取 石蠟包埋組織模板DNA的提取參考文獻[4]進行。1%瓊脂糖電泳鑒定，紫外分光光度儀測定OD值計算出DNA含量。取200ng作為PCR模板。

1.4 引物設計 根據ensembl數據庫中的miR-125b-1基因序列，應用在線引物設計程序primer3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）設計引物，并在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/網站上比對，選擇產物唯一性、大小228bp的引物。引物序列：上游5'-CGAACAGAAATTGCC TGTCA-3'，下游 5'-CAATCACCTCAGACAAACTTT CTT-3'，由上海生工生物技術公司合成。

1.5 PCR擴增 20 μl反應體系，含10×擴增緩沖液2.0 μl，4 種 dNTP 混合物 0.4 μl，引物混合物 2.0 μl，Taq DNA 聚 合 酶 0.1 μl，Mg2+1.2 μl，ddH2O12.3 μl，模板DNA2.0μl。PCR反應條件：94℃預變性10min；94℃變性 30 s，56℃復性 30 s，72℃延伸 30 s，共 35個循環后，最后72℃延伸7min。反應完成后，取5μl反應液用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR產物擴增情況，在預期位置有清晰擴增帶之后進行SSCP。

1.6 SSCP分析 取10 μl PCR產物， 加入 10 μl變性劑 （95%甲酰胺，10mmol/LEDTA，0.02%溴酚藍），95℃變性5 min，立即于冰浴中驟冷，再于10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（120V，4℃電泳18～20 h)。電泳結束后將其浸在含0.5 μg/ml溴化乙錠的1×TBE緩沖液中染色30～45 min，在紫外燈下觀察變性后的二條單鏈電泳遷移率，并比較肺癌患者和正常對照者的結果。

1.7 統計學處理 本組所得數據采用χ2檢驗、非參數統計中Spearman等級相關、Kaplan-Meier生存曲線分析和對數秩和檢驗進行分析，數據統計在SPSS13.0軟件上進行。

2 結 果

2.1 DNA抽提結果 所抽提DNA樣本濃度及純度，均可用于后續實驗研究（PCR反應）。

2.2 PCR擴增產物的鑒定 設計的miR-125b-1PCR產物長度228bp，其中包括含有成熟的miR-125b-1發夾結構前體序列及其兩側序列。在119例肺癌組織和42例肺良性病變組織中全部擴增成功,PCR擴增產物均呈228bp大小的清晰目的片段條帶，由含EB的1%瓊脂糖電泳驗證，見圖1所示。

圖1 PCR擴增產物的電泳圖M為對照物(100～500bp)；1～3為肺癌組織；N為癌旁正常肺組織

2.3 PCR-SSCP分析 119例肺癌組織和42例肺良性病變組織的PCR擴增產物進行SSCP后，在同一膠片中進行比較，單鏈帶出現異常區帶者，視為有突變。結果顯示119例肺癌組織中PCR擴增產物有40例（34%）出現異常泳動區帶，說明在擴增的靶片段中檢測到堿基突變。見圖2。

圖2 PCR-SSCP電泳分析圖ssDNA為單鏈DNA，dsDNA為殘存雙鏈DNA，→為異常泳動區帶

2.4 基因突變與肺癌患者臨床病理和生理特征之間的關系 肺癌組織中miR-125b-1基因突變與淋巴結轉移呈顯著性相關，N分期越高者，發生基因突變概率越高,進一步行Spearman相關分析顯示兩者呈顯著性正相關（r=0.285，P<0.01）；與臨床分期呈顯著性相關，Spearman相關分析顯示兩者呈顯著性正相關（r=0.241，P<0.01）。而 miR-125b-1 基因的缺失與肺癌患者細胞分化程度、病理類型、原發腫瘤分期等均無明顯關系（P>0.05）。見表1。

2.5 肺癌組織中miR-125b-1基因突變與肺癌患者術后生存率的關系 將miR-125b-1基因突變組和未突變組進行Kaplan-Meier生存曲線分析和對數秩和檢驗，結果發現miR-125b-1基因突變組術后生存時間顯著低于非突變組（P<0.05），見圖3。

3 討 論

微小 RNA（microRNAs，miRNA)是一類近年來新發現的長約22個核苷酸 （nt）的非編碼的單鏈RNA分子，在生物中廣泛存在，在進化中高度保守，在生長、發育、分化、增殖、凋亡等生理過程中發揮重要的調控作用。miRNA最新有關研究表明：miRNA與腫瘤緊密關聯，已經證實miR-32、miR-125b-1、let-7與肺癌的發生相關：其中miR-32位于9q31.2，這一區域在許多腫瘤中是缺失高頻區，包括肺鱗癌[5]、膀胱癌[6]、頭頸部腫瘤[7]等，其表達在肺癌中降低。在本文119例肺癌組織中有40例發生突變，突變率34%；而在42例肺良性病變組織中未有突變。本文結果從分子水平說明miR-125b-1基因突變與肺癌的發生、發展可能有密切關系。

表1 miR-125b-1基因缺失與肺癌患者臨床和病理生理特征的關系

圖3 基因突變組和基因未突變組的Kaplan-Meier生存曲線

現有的研究表明：miR-125b-1是長約22個核苷酸（22nt）的非編碼 RNA，它是由長 88nt、帶有發夾結構的pre-miRNA剪切而成，pre-miRNA的序列和結構的變化對于接下來形成成熟的miRNA的剪切反應影響很大[8]，因此在miRNA加工途徑中任何突變,都可能擾亂基因的正常調控而導致腫瘤的發生?？傊甿iR-125b-1基因突變有可能是miR-125b-1表達豐度的下降的原因之一，或與其表達豐度的下降呈現協同作用，使成熟miR-125b-1在肺癌中的功能發生相應改變。

此外，本文比較了肺癌組織中miR-125b-1基因突變與肺癌患者的臨床病理生理特征之間關系，發現基因突變與淋巴結轉移有密切的關系 （P<0.05），且基因突變與淋巴結轉移之間存在正相關關系，提示可能在肺癌細胞的轉移過程中起重要作用，增加患者發生淋巴結轉移的風險性。應用Kaplan-Meier生存曲線分析，發現基因突變是肺癌患者預后不良的危險因素，可能與肺癌進展的某些調控機制有關。

綜上所述，本文結果提示miRNA基因可能參與了肺癌的發生、發展過程。堿基突變很可能改變miRNA的功能，從而誘發腫瘤，檢測腫瘤組織特定miRNA序列是否突變，有利于了解腫瘤發生發展的機理。

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[2009-09-26收稿，2009-10-28修回]