黃芩素磺化物的合成、抗氧化活性及其與DNA作用的研究

何 清,王彥昌,賀 云,張尊聽＊,張小清

1陜西師范大學化學與材料科學學院,西安 710062;

2溫州大學化學與材料工程學院,溫州 325027;3西安醫學院,西安 710021

黃芩素磺化物的合成、抗氧化活性及其與DNA作用的研究

何 清1,2,王彥昌1,賀 云1,張尊聽1＊,張小清3

1陜西師范大學化學與材料科學學院,西安 710062;

2溫州大學化學與材料工程學院,溫州 325027;3西安醫學院,西安 710021

以黃芩素為先導化合物利用磺化反應首次合成水溶性黃酮——黃芩素-8-磺酸鈉,采用 I R、1H NMR和元素分析對黃芩素-8-磺酸鈉結構進行了表征;同時,對磺化反應條件進行了優化。通過DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)法對黃芩素-8-磺酸鈉清除自由基作用進行了研究;以溴化乙錠(EB)為熒光探針,研究了黃芩素-8-磺酸鈉與 CT-DNA的相互作用。實驗結果表明:最佳的磺化反應條件為:黃芩素與濃硫酸比例 1∶8(g/mL),100℃時反應 12 h。黃芩素-8-磺酸鈉具有強抗氧化活性,與DNA結合作用顯著。

黃芩素;黃芩素-8-磺酸鈉;抗氧化活性;CT-DNA

黃芩素 (Baicalein,4氫-1-苯并吡喃-4-酮-5,6,7-三羥基-2-苯)是唇形科植物黃芩的有效成分之一,也存在于紫葳科植物木蝴蝶、車前科植物大車前中,具有抗菌[1]、抗病毒[2]、抗炎[3]、抗變態反應[4]、抗氧化、清除氧自由基[5]、抗癌、抗腫瘤[6]、抗凝、抗血栓形成[7]和保護肝臟、心腦血管、神經元[8]等多種藥理作用,目前臨床主要用于抗菌消炎和抗感染。由于黃酮化合物水溶性較差,限制了其在臨床中的應用。為了改善黃酮化合物的溶解性,解決臨床應用中存在的生物利用度低、吸收差、顯效慢的缺點,我們曾利用磺化反應合成了大豆苷元-3′-磺酸鈉[9]、雙甲氧基大豆苷元-3′-磺酸鈉[10]、尼泊爾鳶尾苷元-3′-磺酸鈉[11]及白楊素-6-磺酸鈉[12]等,并對其晶體結構和生理活性進行了研究。本文探索了黃芩素磺化反應的最佳條件,合成出水溶性化合物黃芩素-8-磺酸鈉,對其進行了結構表征;同時進行了黃芩素-8-磺酸鈉抗氧化活性試驗,研究了其與 CTDNA的作用。黃芩素-8-磺酸鈉在不改變先導化合物黃芩素結構的基礎上引入一個磺酸基,克服了黃芩素水溶性差的缺點,同時保留了黃芩素結構中的活性部位,為黃酮類藥物的劑型改造提供新化合物。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Vario EL III元素分析儀;Nicolet 170SX FT-I R紅外光譜儀 (KBr壓片);Bruker AM-300超導核磁共振儀;UV-1810紫外可見分光光度計;CRT-970熒光分光光度計。

1.2 試劑

黃芩素(成都歐康植化科技有限公司);DPPH (日本東京化成工業株式會社);溴化乙錠 (華美生物工程公司);小牛胸腺DNA(CT-DNA,華美生物工程公司);三羥基甲基氨基甲烷 (Tris,Sigma公司);其它化學試劑均為市售分析純。

2 實驗方法

2.1 黃芩素磺化條件的優化

影響黃芩素磺化反應的主要因素有磺化劑的用量、反應溫度、反應時間等。本實驗采用單因素法確定反應條件。首先,固定反應溫度和時間,1 g黃芩素與不同體積濃硫酸作用,結果見表 1。其次,在反應最佳比率黃芩素∶濃硫酸 =1∶8(g/mL)時,固定反應溫度,延長反應時間,結果見表 2。最后,固定比率和反應時間,升高反應溫度,結果見表 3。

2.2 黃芩素-8-磺酸鈉的合成

稱取 1.0 g黃芩素置于 25 mL燒瓶中,加入 8 mL濃 H2SO4在 100℃下攪拌反應 12 h,倒入 25 mL飽和NaCl水溶液中,析出黃色沉淀,靜置 4 h,過濾,再用飽和NaCl水溶液洗沉淀至中性,將沉淀物加適量水溶解,向溶液中加入 NaCl固體攪拌溶解至出現混濁,加熱溶液使變清亮,靜置過夜,析出淡黃色固體。反復溶解鹽析,直至 TLC檢測已純,得黃芩素-8-磺酸鈉 (圖 1),80℃真空干燥,mp.290℃(分解)。:3541.6,3443.1,1672.3,1618.6,1580.4, 1450.1,1366.0,1315.3,1268.8,1213.5,1158.5, 1109.0,1044.4,1029.2,849.2,778.7,767.8,684.6, 654.8,627.3,586.3,535.1 cm-1;1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:7.04(1H,s,H-3),8.30(2H,d,J= 6.72 Hz,H-2′,H-6′),7.58(2H,d,J=6.72 Hz,H-3′,H-5′),7.57(1H,s,H-4′)。按 C15H9NaO8S的計算值(%):C 48.39,H 2.44;實驗值 (%):C 48.16, H 2.19。

圖 1 黃芩素-8-磺酸鈉的合成路線Fig.1 Route of synthesis of sodium baicalein-8-sulfonate

2.3 清除自由基實驗

2.3.1 溶液的配制

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)溶液:以無水乙醇為溶劑配制濃度為 2.0×10-4mol/L的DPPH溶液。

黃芩素-8-磺酸鈉儲備溶液:以無水乙醇為溶劑配制濃度為 4.0×10-4mol/L的黃芩素-8-磺酸鈉溶液。

2.3.2 抗氧化作用的測定

取稀釋后的黃芩素-8-磺酸鈉溶液 2 mL及 2.0 ×10-4mol/L DPPH溶液 2 mL加入同一具塞試管中,搖勻。30 min后用無水乙醇做參比測定其吸光度Ai,同時測定 2 mL 2.0×10-4mol/L DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度 Ac,以及 2 mL黃芩素-8-磺酸鈉與 2 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj。

DPPH法中抗氧化能力用抑制率來表示,其公式為:

其中,Ac為未加抗氧化劑時 DPPH溶液的吸光度;Ai為加抗氧化劑后 DPPH溶液的吸光度;Aj為黃芩素-8-磺酸鈉在測定波長的吸光度。

分別測定不同濃度黃芩素-8-磺酸鈉溶液對DPPH的抑制率,用抑制率對濃度的對數作圖得抑制率曲線(圖2)。

2.4 與 EB-DNA作用

2.4.1 溶液的配制

Tris-HCl緩沖溶液的配制:以二次去離子水為溶劑配制 50 mmol/L Tris-50 mmol/L NaCl溶液,室溫密封保存,使用前用 HCl調至 pH=7.4。

EB溶液:以緩沖溶液為溶劑配制 3.0×10-5mol/L的 EB溶液。

CT-DNA:以緩沖溶液為溶劑配制 CT-DNA溶液,濃度以吸收系數ε(p)260=6600確定[13],為3.20×10-5mol/L,經 UV光譜檢測 A260/A280> 1.8[13]。溶液置于冰箱中 4℃保存。

黃芩素-8-磺酸鈉溶液:稱取適量黃芩素-8-磺酸鈉,以少量 DMSO溶解后,用緩沖溶液定容并逐級稀釋,配制濃度為 3.0×10-4mol/L的溶液。

2.4.2 與 EB-DNA作用熒光光譜的測定

在 10mL具塞刻度試管中分別加入 3.0×10-5mol/L EB溶液 1 mL,3.20×10-5mol/L DNA溶液 1 mL,室溫下搖勻反應 30 min后,再分別加入不同量的待測化合物,搖勻,30 min后,用緩沖溶液定容至10 mL,以激發波長525 nm,狹縫 Ex=Em=10 nm,在550～750 nm范圍內掃描其熒光發射譜(圖 3)。

3 結果與討論

3.1 黃芩素磺化反應工藝的優化

黃酮類磺化反應屬于親電取代反應機理,黃酮骨架上的-OH、-OCH3可使苯環活化,在它們的鄰、對位發生親電取代反應,得到相應的磺化產物。黃芩素A環上有3個-OH,實驗中得到A環磺化產物。通過單因素實驗,得到黃芩素最佳磺化條件為:黃芩素∶濃硫酸 =1∶8(g/mL),在 100℃反應 12 h。該條件下副產物少,收率高,產率約 75%。

表 1 濃硫酸用量對磺化反應的影響Table 1 Effect of the volume of sulphuric acid on the sulfonation reaction

表 2 反應時間對磺化反應的影響Table 2 Effect of the t ime on the sulfonation reaction

表 3 溫度對磺化反應的影響Table 3 Effect of the temperature on the sulfonation reaction

8 100 12 75 8 120 12 74 8 140 12 70

3.2 黃芩素-8-磺酸鈉的結構表征

黃芩素-8-磺酸鈉在 1672.3 cm-1處的強吸收峰是– C=O的吸收。1109.0(寬而強)、1044.4 cm-1是-S的吸收。黃芩素磺化產物的 1H NMR圖譜和黃芩素的1H NMR圖譜比較相似,B環上所有質子及 C-3位上質子的峰形及化學位移和耦合常數均沒有明顯變化,而 A環上質子消失,說明取代基位于C-8位。

3.3 清除自由基實驗

DPPH是一種穩定的自由基,呈紫色,在 517 nm處有強吸收。有自由基清除劑存在時,DPPH的單電子被配對而使其顏色變淺,在最大吸波長處的吸光度變小,因此,此處的吸光度可以用來檢測自由基的清除情況,從而評價試驗樣品的抗氧化能力。DPPH法用于研究藥物的抗氧化能力較多[15-17],氧化能力用抑制率來表示,抑制率越大,抗氧化性越強。

在黃芩素-8-磺酸鈉抑制率曲線圖 2中,當黃芩素-8-磺酸鈉濃度為 4.0×10-4mol/L時,抑制率高達95%,稀釋 10倍后,對 DPPH仍有 50%清除作用。由圖 1求得黃芩素-8-磺酸鈉對 DPPH的半抑制率I C50(抑制率為 50%時抗氧化劑的濃度)為 4.0× 10-5mol/L,與人工合成的強抗氧化劑 THBQ(特丁基對苯二酚)相當[18],表明黃芩素-8-磺酸鈉對 DPPH有強抑制作用。

圖 2 黃芩素-8-磺酸鈉抑制率曲線Fig.2 Inhibition rate curve of sodium baicalein-8-sulfonate

3.4 對 EB-DNA體系熒光強度的影響

EB是一種典型的嵌入式熒光探針,自身熒光很弱,但嵌入DNA雙螺旋結構后熒光強度顯著增強。如果在 EB-DNA體系中加入的有機小分子M也能夠與DNA發生類似于 EB的嵌入作用,這個小分子就會與EB競爭DNA的結合位點,將EB從EB-DNA復合物中擠出,使 EB-DNA體系的熒光強度降低,因此 EB常作為熒光探針研究DNA與小分子化合物的相互作用[19]。

黃芩素-8-磺酸鈉對 EB-DNA體系熒光強度的影響見圖 3。隨著黃芩素-8-磺酸鈉濃度的增加,EBDNA體系熒光強度顯著降低。令 EB-DNA體系的熒光強度 RF=F/F0(F為添加猝滅劑時 EB-DNA體系的熒光強度,F0為未添加猝滅劑時 EB-DNA體系的熒光強度),RC=CM/CDNA(CM為猝滅劑的濃度,CDNA為DNA的濃度)。實驗結果顯示,在 RC= 40時,RF=65.5%,認為黃芩素-8-磺酸鈉與 DNA發生了顯著作用[20]。隨著黃芩素-8-磺酸鈉濃度的增加,體系熒光強度隨 RC的增大而減小,說明黃芩素-8-磺酸鈉與 EB競爭與 CT-DNA的結合位點,使體系中游離的 EB增多,因而體系的熒光強度降低。

圖 3 黃芩素-8-磺酸鈉對 EB-DNA體系熒光強度的影響Fig.3 Effect of sodium baicalein-8-sulfonate on the emission spectra

4 結論

本實驗通過優化后的反應工藝合成了水溶性化合物黃芩素-8-磺酸鈉,采用 IR、1H NMR和元素分析進行了結構表征。黃芩素-8-磺酸鈉對 DPPH有強抑制作用,半抑制率 IC50為 4.0×10-5mol/L;與DNA作用較強,能使 EB-DNA體系熒光強度顯著降低。

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Synthesis of Sulfonated Ba icalein and Its Antioxidative Activity and Interaction with DNA

HE Qing1,2,WANG Yan-chang1,HE Yun1,ZHANG Zun-ting1＊,ZHANG Xiao-qing31School of Chem istry and M aterials Science,Shaanxi Nor mal University,Xi’an 710062,China;2College of Chem istry and M aterials Science,W enzhou University,W enzhou 325027,China;3Xi’an M edical University,Xi’an 710012,China

A sulfonate was introduced to the molecular structure of baicalein by sulfonation reaction and water-soluble flavone sodium baicalein-8-sulfonate was synthesized.Sodium baicalein-8-sulfonate was characterized by IR,1H NMR, and elemental analyses.And the conditions of sulfonation reaction were optimized.The antioxidative activity of sodium baicalein-8-sulfonate was tested by the method ofDPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical).Furthermore,the interaction of sodium baicalein-8-sulfonate with DNA was studied by fluorescent spectroscopy of EB as a spectral probe in Tris-HCl buffer(pH =7.4).The result indicated that the optimal sulfonation reaction conditions are the ratio of baicalein and sulphuric acid=1∶8(g/mL),temperature 100℃,and t ime 12 h.The antioxidative activity of sodium baicalein-8-sulfonate was stronger than baicalein,and its interaction with DNA was higher.

baicalein;sodium baicalein-8-sulfonate;antioxidative activity;CT-DNA

1001-6880(2010)06-0961-05

2009-05-26 接受日期:2009-07-28

教育部重點項目 (107138);陜西省自然科學基金資助(SJ08B19)

＊通訊作者 E-mail:zhangzt@snnu.edu.cn

Q946.91;R285;O614

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