時間分辨拉曼光譜研究一氧化氮與肌紅蛋白的結合過程

李 濤 呂 榮 于安池

(中國人民大學化學系,北京 100872)

時間分辨拉曼光譜研究一氧化氮與肌紅蛋白的結合過程

李 濤 呂 榮 于安池*

(中國人民大學化學系,北京 100872)

納秒瞬態拉曼光譜技術是研究分子結構變化超快動態過程的重要實驗手段之一.而肌紅蛋白(Mb)與小分子配體的結合過程一直是人們研究的焦點.本文旨在利用納秒瞬態拉曼光譜技術研究小分子配體NO與肌紅蛋白結合的動力學過程.通過考察MbNO光解后產物脫氧肌紅蛋白(DeoxyMb)與反應物MbNO的ν4特征振動峰的強度比值隨激光激發功率的變化,闡述了利用納秒瞬態拉曼光譜技術研究MbNO體系中NO與DeoxyMb結合過程的可行性.利用納秒瞬態拉曼光譜技術,獲得了與皮秒時間分辨拉曼和皮秒時間分辨吸收相一致的結合動力學實驗結果.為研究其它復雜體系的超快結合動力學過程提供了一種新的思路.

納秒瞬態拉曼;皮秒時間分辨拉曼;皮秒時間分辨吸收;肌紅蛋白;一氧化氮;結合過程

肌紅蛋白(myoglobin,Mb)是一種廣泛存在于脊椎動物肌肉細胞中的血紅素蛋白,主要生理功能是為生命有機體儲存和運輸氧氣[1].除此之外,肌紅蛋白還通過可逆地與一氧化碳和一氧化氮等小分子配體結合與釋放來調控其他血紅素蛋白的生理功能[2,3].因此,肌紅蛋白又被稱為“生物學中的氫原子”[4],一直被科學家們作為一個模型體系來研究蛋白質的結構與功能關系[5-7].

雖然一氧化碳、一氧化氮和氧氣分子都可以與肌紅蛋白結合,但它們的結合動力學行為有著很大的差異[8-23].在短脈沖激光作用下,配體以很快的速度解離(>1013s-1),解離后的一氧化氮在兩三百皮秒內便可完全與肌紅蛋白孿生結合(結合幅度>95%)[8-17].一氧化碳則相反,不但孿生結合速度非常慢(微秒量級),而且結合幅度也非常小(＜5%)[8-21];氧氣的結合情況更為復雜,既有非?？斓膶\生結合過程(約為6 ps),又有比較慢的孿生結合過程(約為30 ns)[12,21-23].對引起三種配體結合行為的差異,人們的認識也不盡相同[7,10,11,24-28].一直以來人們認為自旋選擇定律是造成三種配體結合行為差異的內在本質[24-26,28].在非結合態,血紅素鐵原子的自旋態為S=2,而結合態中, MbCO的自旋態為S=0,MbNO的自旋態為S=1/2, MbO2的自旋態為S=0.結合過程中,不同的自旋態中間體可以參與反應從而引起它們結合行為的差異.但最近強磁場條件下的結合動力學實驗結果表明,強磁場對配體的結合動力學行為沒有明顯影響[29].此外,Ionascu等[10]同樣提出了“Harpoon”模型和“Doming”模型來解釋三種配體結合行為的差異.因此,肌紅蛋白與三種小分子配體(O2、NO、CO)結合過程差異的內在原因仍不清楚,仍需更多的實驗來揭示.

時間分辨拉曼光譜已被廣泛地應用于探測反應中間體的結構變化信息和反應歷程[30,31].對于肌紅蛋白體系而言,目前人們主要利用皮秒時間分辨拉曼光譜技術研究肌紅蛋白的結構變化信息[30,32,33],利用皮秒時間分辨拉曼光譜技術研究小分子配體與蛋白結合的動力學過程鮮有報道.此外,納秒瞬態拉曼光譜同樣可以用于跟蹤觀測快反應中間體的反應過程[34-36].與時間分辨拉曼光譜技術相比,納秒瞬態拉曼光譜技術主要是利用一束激光中單脈沖內分子被多次激發的時間間隔來觀測樣品在該時間量級的瞬態過程,即激光的脈沖前沿激發樣品引起化學反應,激光的脈沖后沿探測化學反應的進行.與皮秒時間分辨拉曼光譜技術相比,納秒瞬態拉曼光譜技術的優勢在于可以利用高能量的激光對樣品進行激發及探測,并且有很高的光譜分辨率.缺點是由于是多光子激發過程,相對于單光子激發的時間分辨拉曼光譜技術,數據處理較為復雜.但由于納秒激光系統相對于皮秒激光系統容易操作,因此同樣具有廣泛的應用前景.目前,納秒瞬態拉曼光譜技術對肌紅蛋白體系的研究工作主要集中在針對五配位的脫氧肌紅蛋白(DeoxyMb)激發態性質的研究[34-36],而對于其應用于小分子配體結合過程中的研究還未見文獻報道.

本文將利用納秒瞬態拉曼光譜和皮秒時間分辨拉曼光譜技術對一氧化氮與肌紅蛋白結合的動力學過程進行研究,并與時間分辨吸收實驗結果進行比較,為人們認識小分子配體(NO)與肌紅蛋白的相互作用增加部分實驗依據.

1 實驗部分

馬心肌紅蛋白購于美國Sigma公司,純度≥90%,-20℃密封保存.其它試劑均為AR級國產試劑.取適量Mb,加入800 μL濃度為0.1 mol·L-1,pH為7.2的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中,室溫超聲1-2 min,待其完全溶解后,離心處理,將上清液轉移至厚度為2 mm的石英池中,密封,抽真空,充氬氣,重復3-5次,除去溶解在溶液中的氧氣.隨后加入10 μL濃度約為 1 mol·L-1經過同樣除氧操作的Na2S2O4溶液,充分反應,將Mb還原成DeoxyMb.最后加入5 μL濃度約為1 mol·L-1經過同樣除氧操作的NaNO2溶液,充分反應,制得MbNO樣品溶液.

納秒瞬態拉曼實驗光源由Nd:YAG激光和光學參量振蕩器(Spectra-Physics)產生,波長為435 nm,脈沖寬度為7 ns,重復頻率為10 Hz.拉曼信號采用背向收集方式,信號由三聯-三光柵單色儀(TriVista-555)進行分光,ICCD(PI-Max:1024 18mm-Gen III)采集.激光的功率通過兩個格蘭棱鏡調節.樣品處激光聚焦半徑大小((59±3)μm)由半徑已知的針孔(40 μm)測定.

皮秒時間分辨拉曼和吸收實驗裝置是利用飛秒激光系統(Spectra-Physics)搭建的,由振蕩器、千赫茲放大器和其光學參量放大器組成.皮秒時間分辨拉曼實驗中,泵浦光和探測光的波長分別為540和407 nm,脈沖寬度分別約為150 fs和4 ps,樣品處功率分別為1 mW和90 μW.其中探測光407 nm是由波長為814 nm、脈沖寬度為150 fs的激光先經過倍頻得到407 nm波長的光,然后再由單色儀分光獲得.拉曼信號采用背向收集,經單色儀分光,由CCD (Spec-10:400BR/LN)采集.所得拉曼光譜分辨率約為10 cm-1,峰值精確度約為2 cm-1.皮秒時間分辨吸收實驗中,泵浦光和探測光的波長分別為540和414 nm,脈沖寬度分別約為150 fs和4 ps,樣品處功率分別為0.75 mW和30 μW.信號由光電二極管接收,經鎖相放大器處理.兩種實驗的延時器均放于泵浦光光路上.實驗過程中樣品由自制磁子攪拌器攪拌,以保證激光聚焦區域樣品始終保持新鮮.

實驗中的所有MbNO樣品濃度均約為50 μmol·L-1.實驗前后通過檢驗樣品的吸收光譜檢驗樣品的穩定性.

2 實驗結果

圖1(a-g)為MbNO在不同激光功率密度下獲得的納秒瞬態拉曼光譜,圖1h為MbNO光解產物DeoxyMb的拉曼光譜.圖中獲得的DeoxyMb的穩態拉曼光譜與文獻報道結果[32]完全一致.在MbNO各激光功率密度下的瞬態拉曼光譜中,我們既檢測到了六配位MbNO的特征拉曼振動ν4(1377 cm-1)又檢測到了五配位光解產物DeoxyMb的特征拉曼振動ν4(1358 cm-1),且隨著照射激光功率密度的增大光解產物DeoxyMb所占比例明顯增加.

圖1 不同激光功率密度(F)下MbNO的納秒瞬態拉曼光譜圖(a-g)和DeoxyMb的拉曼光譜圖(h)Fig.1 Nanosecond transient Raman spectra of MbNO at different laser fluxes(F)(a-g)and Raman spectrum of DeoxyMb(h)10-8F/(W·cm-2):(a)0.38,(b)0.76,(c)1.14,(d)1.52,(e)1.90, (f)2.28,(g)2.66

圖2 不同時間延遲下MbNO的皮秒時間分辨拉曼光譜圖Fig.2 Picosecond time-resolved Raman spectra of MbNO at different time delayspump photolysis wavelength:540 nm, Raman probe wavelength:407 nm

圖3 利用1377 cm-1振動峰強度(I)表示MbNO體系中DeoxyMb和NO結合的動力學曲線Fig.3 Rebinding kinetics between DeoxyMb and NO in MbNO by monitoring the peak intensity(I)at 1377 cm-1The adding error bars come from several measurements.

圖2為MbNO在不同時間延遲下的皮秒時間分辨拉曼光譜.由于受激光光解產率(實驗條件下最大光解產率約為10%)的限制,我們在各時間分辨拉曼光譜中并沒有明顯檢測到光解產物DeoxyMb的特征光譜.但是通過分析反應物MbNO在不同延遲下的拉曼光譜,我們發現隨著時間延遲的改變,反應物MbNO的特征振動峰(ν4,1377 cm-1)強度有著明顯的改變,如圖3所示.

圖4為利用時間分辨吸收實驗獲得的DeoxyMb與NO結合的動力學曲線,其中N(t)表示t時刻光解產物的剩余百分數,空心圓圈為實驗數據點,實線為三指數衰減函數擬合曲線,擬合獲得的所有參數(見表1)與文獻報道結果[8,10,12,13,15-17,21]吻合較好.

圖4 利用皮秒時間分辨吸收測得MbNO中DeoxyMb與NO結合的動力學曲線Fig.4 Rebinding kinetics curves between DeoxyMb and NO in MbNO measured by picosecond timeresolved absorptionThe circles are experimental data,the solid line is the fitting result with three-exponential decay function.N(t)is the survival fraction of DeoxyMb at time t.In the figure,all the data have been normalized to 1 at 3 ps.

表1 三指數衰減函數模擬參數Table 1 Fitting parameters with three-exponential decay function

3 數據分析及討論

納秒瞬態拉曼光譜技術是一個多光子激發的過程,即一個脈沖中的光子數遠大于聚焦區域中樣品的分子數.本實驗中,我們所用激光的脈沖寬度為7 ns.由于MbNO光解后DeoxyMb與NO的孿生結合速度很快,在幾百個皮秒內結合幅度就達到95%以上,因此在圖1所有瞬態拉曼光譜中,我們既探測到了光解后五配位產物DeoxyMb的特征振動峰(1358 cm-1),又探測到了反應物MbNO的特征振動峰(1377 cm-1),這充分說明了在一個激光脈沖中同一MbNO分子被激發了很多次.利用公式(1)[35]可以計算單位時間內同一MbNO分子被激發的次數,即MbNO的激發速率(k),

其中F為入射激光的功率密度(W·cm-2),x為樣品MbNO的吸收效率,σ為MbNO分子在激光激發波長處的吸收截面(cm2),Ephoton為入射激光單個光子的能量(J·photon-1).并進而由公式(2)計算出MbNO分子相鄰兩次激發的時間間隔.

實驗條件下,σ435nm(MbNO)=8.15×10-17cm2,Ephotoh(435 nm)=4.57×10-19J·photon-1,x=0.71,由此可以計算出不同入射激光功率密度下MbNO分子相鄰兩次激發的時間間隔,見表2.

表2結果表明,隨著激光功率密度的增大, MbNO分子相鄰兩次激發的時間間隔變小.這表明激光功率密度越大,與單個MbNO分子相互作用的光子數越多,同一個MbNO分子被激發的次數也就越多,即同一MbNO分子相鄰兩次激發的時間間隔就越短.由于MbNO光解后生成的五配位產物DeoxyMb很快會與解離的NO分子發生孿生結合,因此激發時間間隔越短,產物DeoxyMb的量相對于反應物MbNO的比例就越高.產物DeoxyMb與反應物MbNO量的比例大小可以利用圖1中1358與1377 cm-1振動峰的強度比值表示.若將1358與1377 cm-1振動峰的強度比值對相應激發時間間隔作圖,可得圖5.由于相鄰兩次激發的時間間隔可以近似看成樣品被一次激發和一次探測,因此相鄰兩次激發的時間間隔等同于時間分辨拉曼光譜技術中泵浦與探測之間的時間延遲,所以圖5中的曲線與圖4中的曲線呈現出很大的相似性.

表2 不同入射激光功率密度(F)下單個MbNO分子相鄰兩次激發的時間間隔(t)Table 2 Excitation time intervals(t)of a single MbNO at different laser fluxes(F)

圖5 MbNO納秒瞬態拉曼光譜中1358與1377 cm-1的峰強度比與激發時間間隔的關系Fig.5 Relationship between the peak intensity ratio of 1358 and 1377 cm-1in the nanosecond transient Raman spectrum of MbNO and the excitation time interval

圖6 納秒瞬態拉曼、皮秒時間分辨拉曼和皮秒時間分辨吸收實驗結果對比Fig.6 Comparison results on nanosecond transient Raman,picosecond time-resolved Raman,and picosecond time-resolved absorptionIn the figure,all the data have been normalized to 1 at 30 ps.

綜上,我們利用皮秒時間分辨拉曼(圖3)、皮秒時間分辨吸收(圖4)和納秒瞬態拉曼(圖5)三種實驗手段分別測得了MbNO體系中DeoxyMb與NO結合的動力學行為.其中圖3為通過檢測反應物MbNO的變化來表征,圖4為通過檢測產物DeoxyMb的變化來表征,而圖5為通過檢測不同激光功率密度下產物DeoxyMb與反應物MbNO的相對比值的改變來表征.雖然三種實驗手段測定方法不同,但它們測定的同為MbNO分子光解后DeoxyMb與NO結合的動力學過程.若將圖3、圖4和圖5作一對比,應該獲得相同的實驗結果.圖6為三種實驗結果的對比圖,圖中的所有數據都歸一于30 ps處.通過對比可以發現三種實驗技術給出了非常相近的結合動力學曲線,這說明我們同樣可以利用較為簡單的納秒瞬態拉曼光譜技術,通過改變激光照射于樣品的強度來研究MbNO體系中光解后DeoxyMb與NO結合的動力學過程.該實驗的有效性同樣為研究其它化學或生物中復雜體系的結合動力學過程提供了一種新思路.

4 結 論

通過改變激光功率獲得MbNO分子在不同激光功率下的瞬態拉曼光譜.通過分析光解產物DeoxyMb和反應物MbNO的ν4特征振動峰強度比值與照射于樣品的激光功率即單個分子激發時間間隔的關系,獲得了與傳統時間分辨吸收和時間分辨拉曼光譜實驗相一致的DeoxyMb與NO的結合動力學行為.實驗結果表明利用較為簡單的納秒瞬態拉曼光譜技術同樣可以研究MbNO體系中DeoxyMb與NO超快結合過程.該實驗的成功為人們研究其它化學或生物中復雜體系的超快結合動力學過程提供了一種新思路.

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September 14,2009;Revised:October 27,2009;Published on Web:November 25,2009.

Recombination Process between Myoglobin and NO Studied by Time-Resolved Raman Spectroscopy

LI Tao Lü Rong YU An-Chi*
(Department of Chemistry,Renmin University of China,Beijing 100872,P.R.China)

Nanosecond transient Raman spectroscopy is a widely used technique to investigate ultrafast structural dynamics in molecules.We studied the rebinding kinetics between deoxymyoglobin(DeoxyMb)and NO using nanosecond transient Raman spectroscopy.By monitoring the ratio between the intensity of the ν4vibrational mode in thephotoproduct(DeoxyMb)andinthereactant(MbNO)atdifferentincidentlaserfluxes,weobtainedtherecombination kinetics between DeoxyMb and NO in MbNO.For comparison,the kinetics of NO rebinding to DeoxyMb in MbNO was also studied using picosecond time-resolved Raman and absorption experiments.The kinetics results obtained with nanosecond transient Raman were consistent with those obtained by picosecond time-resolved Raman and absorption experiments.

Nanosecond transient Raman;Picosecond time-resolved Raman;Picosecond time-resolved absorption;Myoglobin;NO;Recombination

O643

*Corresponding author.Email:a.yu@chem.ruc.edu.cn;Tel:+86-10-62514601.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20603047,20733001).

國家自然科學基金(20603047,20733001)資助項目