IL-19對哮喘模型大鼠氣道平滑肌細胞增殖的影響

李年珍，張煥萍，柴景偉，張 彬

（1.山西醫科大學，太原 030001；2.山西醫科大學第一臨床醫學院呼吸內科，太原 030001）

氣道平滑肌細胞（ASMCs）在哮喘氣道慢性炎癥、氣道高反應性及氣道重塑中均具有十分重要的作用。近年來研究表明，ASMCs不僅具有收縮和增殖功能，而且還有分泌功能［1］。ASMCs可分泌一些細胞因子、炎癥因子和趨化因子，這些介質又可作用于ASMCs對細胞的增殖、凋亡進行調節。ASMCs在哮喘的發病及進展中扮演很重要的角色。IL-10在哮喘中的作用比較明確，IL-10對氣道炎癥起抑制作用。因IL-19與IL-10具有同源性，推測 IL-19也具有和 IL-10相似的生物學活性［2-4］。關于 IL-19的生物學作用尚存在爭議。IL-19對哮喘的具體作用尚無相關報道。

本實驗通過制備大鼠哮喘模型，培養大鼠葉支氣管ASMCs，用不同濃度的IL-19干預細胞生長，觀察ASMCs的增殖的變化。探討IL-19對體外培養的哮喘平滑肌細胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、Ⅰ型膠原酶（collagenase）為美國 Sigma公司產品；DMEM培養基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物所）；小鼠抗α平滑肌肌動蛋白（α-actin）單克隆抗體購自博士德公司；白細胞介素-19（IL-19）購自美國Peprotech公司。余為進口或國產試劑，分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型的建立 健康雄性 W istar大鼠，體重200～250 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供［SCXK（普）070101］。適應性喂養1周后，第1天大鼠腹腔注射含100 mg OVA和200 mg氫氧化鋁的生理鹽水1 m L，同時腹腔注射百日咳桿菌疫苗1 m L（約6×109個菌株）作為佐劑，第8天重復致敏1次，第15天開始激發，將大鼠置于特制玻璃容器內，用超聲霧化器噴入2％OVA生理鹽水50 m L，激發30 m in，每天1次，激發8周。激發后大鼠出現煩躁、嗆咳、呼吸加快及輕度紫紺等哮喘發作癥狀。正常大鼠以等量生理鹽水代替OVA注射，并吸入生理鹽水50 mL8周。

1.2.2 ASMCs的分離、培養及鑒定 參照 Johnson等［5］的培養方法，上述大鼠腹腔注射25％烏拉坦（4 m L/kg）麻醉后，開胸迅速取出肺臟置于預先冰浴的D-hanks’溶液，在解剖顯微鏡下仔細分離出葉支氣管，并將支氣管外膜剝離干凈，刮除內皮，將獲得的單層ASM在青霉素小瓶中剪成1 mm×1 mm的小塊后，加入1 g/LⅠ型膠原酶，37℃，5％CO2培養箱中消化1 h后加入DMEM液，混勻后用金屬濾網過濾，濾液置離心管內1000 r/m in離心6 min。棄上清后，沉淀的細胞用含20％FBS、青霉素100 U/m L、鏈霉素100 U/m L的DMEM培養液重懸，接種到培養瓶內，讓細胞貼壁生長。原代培養的細胞生長約7～10 d后融合。0.25％胰蛋白酶消化傳代，以含10％FBS、青霉素100 U/m L、鏈霉素100 U/m L的DMEM培養液傳代培養，每3～4d換液1次，約4～5 d細胞長滿后傳代，3～8代的細胞用于實驗。小鼠平滑肌α-肌動蛋白（α-actin）免疫細胞化學染色鑒定為ASMCs［6］。

1.2.3 實驗分組 取第3～8代培養的大鼠氣道平滑肌細胞，0.25％胰蛋白酶消化，臺盼藍染色法計數，細胞存活率大于96％。用含10％FBS的DMEM培養，待細胞90％融合后，換無血清DMEM培養24 h，使細胞生長同步于 G0期，換用含 10％FBS的DMEM液，隨機分為5組：（1）對照組：培養的正常大鼠ASMCs，每孔/瓶中不加任何干預；（2）哮喘組：培養的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中不加任何干預； （3）、（4）、（5）組分別為不同濃度的 IL-19干預組：培養的哮喘大鼠 ASMCs，每孔/瓶中分別加入終濃度為1μg/L、10μg/L、100μg/L的 IL-19放入 CO2培養箱中共培養12 h，進行下述實驗。每4個復孔/瓶為一組，實驗重復3次。

1.2.4 細胞增殖檢測

1.2.4.1 流式細胞儀分析 ASMCs細胞周期：

ASMCs按106/m L的密度接種于100 cm2的培養瓶，培養及分組如前述，收集的ASMCs用PBS液配制成濃度為1×106個/m L的細胞懸液，用預冷的75％乙醇固定，加入 RNA酶、碘化丙啶室溫作用后，用FACSort型流式細胞儀（美國BD公司）Cellquest軟件分析細胞周期中各期所占的百分比。

1.2.4.2 四甲基偶氮唑藍（MTT）微量比色法測定ASMCs增殖： 96孔板內的ASMCs培養結束時，每孔加MTT（5 g/L）20μL，培養4 h后去培養液，加二甲基亞砜150μL振蕩30 min，使結晶物充分溶解。酶聯免疫檢測儀于490 nm處測定各孔A值。

1.2.5 統計學方法 應用統計分析軟件包SPSS13.0進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差表示。組間差異顯著性檢驗采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞鑒定

在倒置顯微鏡下，經原代培養的 ASMCs呈梭形，有較長的突起，圓形的細胞核位于細胞中央，呈疏密相間、典型“峰和谷”生長狀態（彩插2圖1）。α-actin免疫細胞化學染色，免疫反應產物呈棕黃色。97％細胞α-actin染色陽性，所培養的細胞為平滑肌細胞［6］（彩插2圖2）。

2.2 流式細胞儀分析 ASM Cs細胞周期

與對照組ASMCs比較，哮喘組ASMCs的G0/G1期細胞所占比例明顯減少（P＜0.01），S期細胞所占比例增高（P＜0.01），表明處于有絲分裂期的細胞數目增多。而加入不同濃度 IL-19共培養 12 h后，10μg/L、100μg/L IL-19干預組 S期細胞所占比例較哮喘組都明顯下降（P＜0.01），但仍高于對照組（P＜0.01）（表1和圖3）。同時這兩個濃度IL-19干預組ASMCs的G0/G1期細胞所占比例較哮喘組明顯增高（P＜0.01），但仍低于對照組（P＜0.01）。且上述兩個指標兩個濃度干預組間比較有差異（P＜0.01）。但1μg/L IL-19干預組以上指標與哮喘組并無統計學差異（P＞0.05）。

2.3 M TT檢測ASM Cs增殖

與對照組相比，哮喘組ASMCs A值顯著增加（P＜0.01），10μg/L、100μg/L IL-19干預組ASMCs A值較哮喘組相比均顯著降低（P＜0.01），但仍高于對照組（P＜0.01）（表1和圖4）。而1μg/L IL-19干預組ASMCs A值與哮喘組并無統計學差異（P＞0.05）。

圖3 流式細胞儀分析各組大鼠氣道平滑肌細胞周期Fig.3 Analysis of cell cycle of ASMCs by flow cytometry

表1 IL-19對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖的影響（n=3）Tab.1 IL-19effect on cell proliferation of ASMCs in asthmatic rats（n=3）

圖4 MTT法檢測各組大鼠氣道平滑肌細胞的增殖A：對照組 B：哮喘組 C：1μg/L IL-19組D：10μg/L IL-19組 E：100μg/L IL-19組注：*P＜0.01與對照組比較；#＊＊P＞0.05與哮喘組比較；#*P＜0.01與哮喘組比較Fig.4 Proliferaion of ASMCs were detected by MTT A：Control group；B：Asthmatic group；C：1μg/L IL-19 group；D：10μg/L IL-19 group；E：100μg/L IL-19 group.Note：*P＜0.01 compared with control group；#＊＊P＞0.05compared with asthmatic group；#*P＜0.01 compared with asthmatic group

3 討論

支氣管哮喘是一種由多種炎癥細胞、炎癥介質和細胞因子共同參與并相互作用的氣道慢性炎癥性疾病。在氣道炎癥中，氣道平滑肌細胞（ASMCs）不僅有收縮功能，而且有合成分泌炎癥介質的功能。ASMCs在哮喘氣道炎癥、氣道高反應性與氣道重構中有重要作用。多種炎癥介質和炎性細胞產物又可作用于ASMCs，對ASMCs的增殖進行調節。增殖的ASMCs使氣道壁增厚，導致基礎氣道阻力增加和不可逆性氣流受限的發生。

白細胞介素-19（IL-19）是新近發現的 IL-10超家族成員中的一員。IL-10被廣泛認為是系統性的抑制炎癥反應的細胞因子［7］。因 IL-19與IL-10具有同源性［8］，推測IL-19也具有和IL-10相似的生物學活性。關于IL-19的生物學作用尚存在爭議。在Sommerville［9］研究IL-19對受損血管平滑肌的作用過程中，發現在它可使受損血管平滑肌增殖減少。但它對哮喘大鼠氣道平滑肌細胞的作用目前還尚無報道。實驗結果表明：一定濃度 IL-19可使慢性哮喘大鼠氣道平滑肌細胞增殖減弱，處于增殖期的細胞數目減少。提示IL-19對體外培養的哮喘氣道平滑肌細胞有抑制增殖的作用。這與IL-19可使受損血管平滑肌增殖減少的報道一致。我們還發現隨著IL-19干預濃度的增高，處于增殖期的細胞比例逐漸減少但仍高于正常對照組，提示可能所選擇的IL-19干預濃度仍較低，或者ASMCs上還可能存在其它類型的促進細胞增殖的信號轉導通道，有待進一步研究。

以上實驗結果表明，一定濃度的 IL-19可以抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖。目前對于已形成的氣道重塑當前尚無特效藥物，大力加強防治哮喘氣道重塑藥物的研究勢在必行，本課題為哮喘的防治提供了新思路。關于IL-19抑制哮喘氣道平滑肌細胞增殖的具體機制還未完全闡明，有待進一步研究。

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