煙酰胺磷酸核糖轉移酶在大鼠涎腺的表達及定位

趙西博,張 歆,李秀秀,高 媛,向 彬,張福胤

(1.大連醫科大學口腔醫學院 口腔頜面外科,遼寧 大連 116044;2.大連育明高中,遼寧大連 116023;3.大連大學醫學院 口腔系,遼寧大連 116622)

煙酰胺磷酸核糖轉移酶在大鼠涎腺的表達及定位

趙西博1,張 歆2,李秀秀3,高 媛3,向 彬3,張福胤1

(1.大連醫科大學口腔醫學院 口腔頜面外科,遼寧 大連 116044;2.大連育明高中,遼寧大連 116023;3.大連大學醫學院 口腔系,遼寧大連 116622)

[目的]研究煙酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt)在大鼠涎腺的表達和分布。[方法]應用半定量逆轉錄聚合酶鏈法(RT-PCR)和免疫印跡法檢測大鼠正常腮腺、頜下腺和大舌下腺組織Namp tm RNA及蛋白質的表達。采用免疫組織化學法檢測大鼠腮腺、頜下腺和大舌下腺組織Namp t的分布。[結果]大鼠腮腺、頜下腺和大舌下腺組織均有 Nampt的mRNA及蛋白質表達,RT-PCR結果顯示其表達相對光密度值分別為：腮腺 82.04%,頜下腺 50.89%,大舌下腺30.53%(與 actin比較,P＜0.05);Western Blot結果顯示其表達相對光密度值分別為：腮腺 77.34%,頜下腺 47.61%,大舌下腺 31.78%(與 actin比較,P＜0.05)。Nampt均主要分布于漿液性腺泡細胞的胞漿和胞核,以及閏管和紋狀管的胞核中。[結論]大鼠腮腺、頜下腺和大舌下腺均存在Nampt的 mRNA和蛋白質表達,為深入研究Nampt在涎腺生理及病理狀態下的功能意義提供初步實驗依據。

煙酰胺磷酸核糖轉移酶;腮腺;頜下腺;大舌下腺

煙酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt)是細胞內氧化型輔酶 I(nicotinam ide adenine dinucleotide,NAD)生物合成的限速酶,廣泛表達在內臟脂肪、骨髓基質細胞、活化的淋巴細胞、巨噬細胞、肝臟、脾臟、子宮、胸腺、胰腺、肌肉組織及胎膜等組織[1]。近年研究表明,Nampt不僅在細胞代謝、生長、增殖及分化的調節中起著重要作用,而且參與癌癥、炎癥、急性肺損傷及其他應激反應[2-6]。但涎腺中有否 Nampt的表達,國內外尚未見文獻報道。本實驗采用形態學及分子生物學方法,從蛋白質及基因水平研究 Nampt在大鼠腮腺、頜下腺和大舌下腺的分布和表達,為深入研究 Nampt在涎腺生理及病理狀態下的功能意義提供初步實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康成年 Wistar大鼠 6只,體重 200～250 g,雌雄不限,購自大連醫科大學 SPF動物實驗中心。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑購自 Invitrogen公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國 Fermentas公司;2×Taq PCR MasterMix購自北京天根生物技術公司;兔抗鼠 Nampt多克隆抗體購自美國 Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標記的二抗及濃縮型 DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;其余試劑均為國產分析純化學試劑。PCR儀(TC-512,TECHNE,英國),熒光凝膠成像系統(UVP BioChem i System,美國)。

1.3 RT-PCR檢測 Nampt mRNA在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺的表達

在 2%戊巴比妥鈉麻醉下(20 mg/kg)分別取大鼠正常腮腺、頜下腺及大舌下腺組織約 20mg,Trizol法提取 RNA。再取 5μg RNA,進行 RT-PCR。根據 GenBank中大鼠 Nampt全基因序列(基因登錄號：NM_177928)設計引物;Nampt上游引物為 5′-ATAGGGGCATCTGCTCATTT-3′;Nampt下游引物為 5′-ACTgTgCTCTGCCGCTGGAA-3′。 β-actin上游引物為 5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′;β-actin下游引物為 5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。設不加逆轉錄產物為陰性對照,以胰腺組織為陽性對照,引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR的擴增條件：94℃預變性 2 min,98℃10 s,68℃30 s3個循環后接 98℃ 10 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s 27個循環,之后 72℃充分延伸 5 min。PCR產物經 1.5%瓊脂糖凝膠電泳,DNA綠結合后在紫外燈下觀察,UVP BioChemi System凝膠成像系統拍照,LEICA-Q-550IW圖像分析系統對 PCR結果進行光密度掃描和分析。

1.4 Western Blot檢測 Nampt蛋白在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺的表達

大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺組織經裂解和離心后,取上清液 Bradford法測定蛋白。再取 80μg蛋白質于 12%十二烷基硫酸鈉 -聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝膠電泳后,轉至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difuoride,PVDF)。電轉后10%脫脂奶粉室溫封閉 2 h,一抗的抗體(稀釋度為 1∶500)4℃孵育過夜。經 PBST沖洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育 2 h,化學發光劑發光并觀察結果,以胰腺組織為陽性對照。用 LEICA-Q-550IW圖像分析系統對所得區帶的積分光密度進行掃描分析。

1.5 免疫組織化學方法(ABC法)檢測 Nampt蛋白在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺的分布

在 2%戊巴比妥鈉麻醉下(20 mg/kg)取大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺組織,制備石蠟切片,用0.3%的 H2O2甲醇溶液室溫孵育 30 min以阻斷內源性過氧化物酶,20%的馬血清室溫封閉 20 min后加入兔抗鼠 Nampt抗體,37℃孵育 1 h后 4℃過夜。用生物素標記的二抗室溫下孵育2 h,辣根過氧化物酶標記的親和素室溫下孵育 30 min,3,3'-二氨基聯苯胺(3,3'-diam inobenzidine,DAB)顯色,蘇木素復染。陰性對照使用正常馬血清代替一抗。

1.6 統計學方法

使用 SPSS 15.0軟件進行數據分析,兩組間差異顯著性比較采用 t檢驗,多組資料分析采用單因素方差檢驗(ANOVA),P＜0.05表示差異具有顯著性意義。

2 結 果

2.1 NamptmRNA和 Nampt蛋白的表達

Nampt在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺的表達：用大鼠 Nampt基因特異性引物對腮腺、頜下腺及大舌下腺的 cDNA進行擴增,以胰腺做陽性對照,擴增出 109 bp大小的 cDNA片段,不加逆轉錄產物的陰性對照未見條帶(圖 1),證明大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺均有 Nampt的 mRNA的存在,其表達相對光密度值分別為：腮腺 82.04%,頜下腺 50.89%,大舌下腺 30.53%(與 actin比較,P＜0.05)。免疫印跡方法結果顯示,大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺總蛋白中存在能夠與抗 Nampt抗體特異結合的條帶,說明在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺中有 Nampt蛋白質的表達,其表達相對光密度值分別為：腮腺77.34%,頜下腺 47.61%,大舌下腺 31.78%(與 actin比較,P＜0.05)(圖 2)。 RT-PCR和 Western Blot結果一致顯示 Nampt在大鼠涎腺的表達豐度腮腺最高,頜下腺次之,最少的是大舌下腺。

圖1 大鼠涎腺NamptmRNA的表達Fig 1 Them RNA expression of Namp t in salivary glands of rat

圖2 大鼠涎腺 Nampt蛋白質的表達(胰腺為陽性對照)Fig 2 The p rotein exp ression of Nampt in salivary glands of rat

2.2 Nampt蛋白的分布

Nampt在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺的分布：光鏡下觀察,Nampt免疫組化陽性染色為棕黃色顆粒,在大鼠涎腺中主要分布于漿液性腺泡細胞的胞漿和導管細胞的胞核中(圖 3 B、D和 F)。

3 討論

Nampt亦稱前 B細胞克隆增強因子(Pre-B cell colony enhancing factor,PBEF)或內臟脂肪素(Visfatin),其氨基酸序列在各物種間具有高度同源性。Nampt在哺乳動物體內有兩種形式：細胞內Nampt(intracellular Nampt,iNampt)和細胞外 Nampt(extracellular Nampt,eNampt)。iNampt已經被證明是 NAD的生物合成限速酶[7],但 eNampt的功能卻依然存在廣泛的爭議。Nampt具有二聚體結構,源于一條 Nampt鏈的 193位苯丙氨酸與另一鏈的 18位酪氨酸在二聚物的交界面上形成兩個與其催化產物煙酰胺單核苷酸(nicotinam ide mononucleotide,NMN)結合的活性位點,而每一單鏈上 Ser280-(絲氨酸)His247-(組氨酸)-Asp313(天冬氨酸)形成的三聯體對該酶的催化活性亦至關重要,His247突變后,Nampt將喪失酶的活性[8]。Nampt的 mRNA有 3個轉錄產物,分別長 2.0 kb,2.4 kb和 4.0 kb,均可被有絲分裂原誘導及放線菌重復誘導,其中以 2.4 kb的轉錄產物占優勢,中間 1476個核苷酸構成開放讀碼框架,編碼 491個氨基酸,分子量為54 kD[9]。

Nampt在許多組織細胞的生理及病理過程中起著重要的調節作用,例如：(1)調節細胞生長、增殖及分化：PBEF最早在淋巴細胞中被發現,是 B細胞早期分化的一種生長因子,可以增強白細胞介素 -7(IL-7)促進前 B細胞向 B細胞轉化的能力[9];PBEF是血管平滑肌細胞分化成熟的關鍵因素[10];同時,Visfatin可以促進血漿葡萄糖轉化為甘油三酯,促進甘油三酯在前脂肪細胞的積聚。提示 Visfatin可以通過旁分泌途徑作用于內臟脂肪組織,促進脂肪組織的分化、合成及積聚[11]。(2)調節細胞代謝：Nampt是細胞內 NAD生成的限速酶。在哺乳動物細胞中,Nampt可以催化煙堿和磷酸核苷焦磷酸轉變為 NMN,NMN在煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉移酶的作用下轉化為 NAD。在 Nampt表達的人類血管平滑肌細胞,Nampt可通過增加細胞 NAD水平,激活 sirtuins家族,使平滑肌細胞 SIRT1的活性增加,導致 p53基因的組蛋白去乙?；?抑制 p53轉錄,使平滑肌細胞 p53的表達降低,從而延長細胞壽命。因此,Nampt近年也被認為是一種可以延緩人類細胞衰老的因子[6]。(3)類胰島素作用：Visfatin具有像胰島素一樣降低血糖的作用。Visfatin能增強 3T3-L1脂肪細胞和 L6肌細胞對葡萄糖的攝取,抑制肝細胞葡萄糖的釋放;將重組 Visfatin注入胰島素抵抗的肥胖小鼠和有胰島素分泌缺陷的小鼠中,可以使血糖水平顯著下降。在 Visfatin基因敲除的小鼠,其血漿 Visfatin水平下降,血糖濃度升高[11]。(4)參與炎癥：在急性肺損傷動物模型的支氣管肺泡灌洗液和膿毒血癥患者的中性粒細胞中,PBEF的表達明顯增加[3,12];另外,PBEF可通過抑制半胱氨酸蛋白酶 caspase-8和 caspase-3的活性,抑制中性粒細胞的凋亡[3]。(5)參與癌癥：FK866(一種高度特異的非競爭性 Nampt抑制劑)可誘導人肝癌細胞 HepG2凋亡[4];Nampt在人卵巢癌組織中表達顯著增加[13]。由此可見,Nampt在不同組織或細胞中具有不同的生理及病理學意義和作用。在涎腺有無表達及其生理及病理意義尚未見文獻報道。

圖3 Nampt在大鼠涎腺的定位Fig 3 The dislocation of Nampt in salivary glands of rat

本實驗在基因及蛋白質分子水平研究了 Nampt在大鼠三大涎腺的表達。RT-PCR結果顯示,Nampt基因在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺均有表達,其表達豐度最高為腮腺,其次為頜下腺,最少的是大舌下腺,其差異有顯著性意義。免疫印跡實驗亦檢測到 Nampt蛋白質在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺均有表達,其表達豐度與 RT-PCR檢測結果一致,差異有顯著性意義。從而在基因及蛋白質水平兩方面證明了 Nampt在大鼠腮腺表達最多,頜下腺次之,大舌下腺最少。采用免疫組織化學的方法首次發現 Nampt蛋白質在大鼠腮腺、頜下腺及大舌下腺均有表達,分布在細胞漿和細胞核中,且以漿液性腺泡細胞的胞漿及閏管、分泌管的胞核中表達為主。所以,Nampt在三大涎腺表達豐度不同的原因可能與各涎腺的性質有關(大鼠腮腺是純漿液性腺,大鼠頜下腺是以漿液性腺為主的混合性腺,大鼠大舌下腺是以粘液性腺為主的混合性腺)。文獻報道在神經細胞株 PC-12,細胞內 Nampt定位表達在胞漿、胞核和線粒體。在生理狀態下,胞漿的表達多于胞核;然而,給予神經生長因子預孵育后,胞漿的表達卻少于胞核[14]。從而提示 Nampt不是細胞因子樣蛋白質,而是細胞內與調節細胞周期相關的蛋白質。但是,Nampt在涎腺不同性質腺泡細胞的分布和表達的差異的意義尚不清楚,其病理生理學作用及機制還有待更深入的研究。

已有研究表明,Nampt受多種因素的調節,地塞米松可以上調分化的 3T3-L1脂肪細胞 Nampt的表達,而生長激素和異丙腎上腺素等則明顯下調3T3-L1脂肪細胞 Nampt的表達,且呈時間劑量依賴性[15];IFN-γ可以上調 B細胞中 Nampt的表達[16];腫瘤壞死因子 (TNF-α)、白細胞介素 6(IL-6)均可顯著抑制 Visfatin的轉錄水平[15,17]。然而,Nampt在涎腺的信號分子調節途徑尚需探討。

Nampt是一種新發現的具有結合并激活胰島素受體、模擬胰島素作用的肽類激素,同時在不同的組織和細胞還具有多種不同的生物學效應。Nampt在涎腺的存在,其生理及病理學意義和作用仍有待闡明。Nampt在涎腺表達的發現為研究涎腺生理功能及疾病的發病機制增加了新內容,更可能成為涎腺疾病治療中抗炎及抗腫瘤的一個新的藥理學靶點。

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Exp ression and localization of nicotinamide phosphoribosyl transferase in salivary glands of rat

ZHAOXi-bo1,ZHANGXin2,LIXiu-xiu3,GAO Yuan3,XIANGBin3,ZHANG Fu-yin1
(1.Department of Oral Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,Dalian Medical University,Dalian 116044,China;2.Dalian Yum ing Senior High School,Dalian 116023,China;3.Departmentof Oral Medicine,Medical College,Dalian University,Dalian 116622,China)

[Objective]To investigate the expression and distribution of nicotinamide phosphoribosyl transferase(Nampt)in rat salivary glands.[Methods]The exp ressions of NamptmRNA and p rotein were investigated by reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RT-PCR)and Western Blot in the parotid,submandibularandmajor sublingualglands of rat.Immunohistochemical assay was applied to detect the distribution of Nampt in these glands too.[Results]The results of RT-PCR showed that the optical density of the expression of NamptmRNA was 82.04%,50.89%and 30.53%respectively in the parotid,submandibular and major sublingual glands of rat(P＜0.05,compared with actin).The results of Western blotshowed that the optical density of the expression of Nampt protein was 77.34%,47.61%and 31.78%,respectively in these glands(P＜0.05,compared with actin).Namptprotein waswidely distributed in them,mainly localized in the cytoplasm and nucleus of both serous acinarcells and ductal cells.[Conclusions]NamptmRNA and protein are exp ressed in the parotid,submandibu lar and major sublingual glands of rat,and may be involved in underlyingmechanisms of physiology and patho-physiology in the salivary glands.

nampt;parotid gland;submandibular gland;major sublingual gland

R 780.2

A

1671-7295(2011)01-0001-05

國家自然科學基金項目(30973335);遼寧省教育廳高?？蒲许椖?2008026)

2010-12-03;

2010-12-16

趙西博(1982-),男,河南濮陽人,碩士研究生。

張福胤,教授。E-mail：zhangfuyin@msn.com