槲皮素保護少突膠質前體細胞缺氧低糖損傷的體外研究

王興啟，劉 軒，楊麗華，于紅麗，翟 玥，劉 靜，姚瑞芹

(徐州醫學院神經生物學教研室，江蘇徐州 221002)

研究發現，缺血缺氧可以導致腦氧化損傷、興奮毒性損傷、炎癥反應等并可能誘發腦室周圍白質軟化?。?－2］(periventricular leukomalacia，PVL)。OPCs受損和神經纖維脫髓鞘是PVL的最大特征。中樞神經系統能夠通過誘導OPCs分化為成熟的少突膠質細胞進行髓鞘再生。因此，保護和減少OPCs損傷是減緩 PVL發展的關鍵。槲皮素(quercetin，QUE)是一種天然黃酮類物質，它們具有良好的促細胞增殖和細胞保護作用［3－4］。此外，槲皮素的多種神經保護作用也得到研究證實［5－6］。因此它可能在抗OPCs損傷中有良好的效果。但槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷的保護效果如何并未見相關報道。本研究將在Na2S2O4誘導的OPCs損傷模型基礎上探討槲皮素不同孵育方法對OPCs缺氧低糖損傷的保護效果。

1 材料與方法

1.1 材料新生1～2 d SD大鼠(♀♂不拘)，由徐州醫學院實驗動物中心提供，生產許可證號:SCXK(蘇)2005－0005;使用許可證號:SYXK(蘇)2005－0018;DMEM/F12(1∶1)、重組人堿性成纖維細胞生長因子和重組人血小板衍化生長因子均購于Gibco公司;槲皮素購于Sigma公司;胎牛血清(FBS)購于杭州四季青生物工程材料有限公司;兔多克隆抗體A2B5購于武漢USCN SCIENCES公司;連二亞硫酸鈉購于南京博湃生物技術有限公司;CCK-8檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 細胞培養高純度OPCs分離、純化和培養，參照 Chen 等［7］的方法。

1.3 建立缺氧低糖損傷模型純化的OPCs培養3 d后棄去培養基，漂洗2次后加入含2 mmol·L－1Na2S2O4的低糖培養基繼續培養，旋緊瓶口，正常對照組仍用原來方法培養。Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測對照組、0.5 h組、1 h組和1.5 h組的細胞凋亡情況。

1.4 CCK-8法檢測細胞存活率檢測1～100 μmol·L－1槲皮素分別處理OPCs 12 h對其活性的影響。將純化的OPCs接種于96孔板中，分為6組，每組設5個復孔，每孔100 μl培養基，每天半量換液，3 d后分別在對照組及各槲皮素濃度組每孔中加入10 μl的CCK-8溶液繼續孵育4 h。槲皮素共孵育和預孵育比較實驗則分別設7組，即對照組、OGD組和1～81 μmol·L－1槲皮素組。酶聯儀檢測細胞D450值。細胞相對存活率=模型組D450值/正常對照組D450值。共孵育是指OPCs缺氧低糖損傷的同時各組加入相應濃度的槲皮素，而預孵育是指各組用相應濃度槲皮素預先孵育3 h后再行缺氧低糖損傷。損傷時間選擇1.5 h。

1.5 LDH漏出率測定分組方法同上，處理方法按照LDH測定試劑盒操作說明書進行。

1.6 槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷形態學的影響將純化的OPCs接種于6孔板中，分為4組，即對照組、OGD 組、81 μmol·L－1槲皮素共孵育組和預孵育組。缺氧低糖損傷后分別在鏡下觀察各組在形態學上的改變。

1.7 統計學處理所有數據用SPSS 16.0軟件分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數據用±s表示。

2 結果

2.1 不同濃度槲皮素對細胞活性影響采用不同濃度(1、3、9、27、81、100 μmol·L－1)的槲皮素處理OPCs 12 h后，測定每組細胞相對存活率。結果表明:當其濃度達到 100 μmol·L－1時細胞活性受到明顯影響(P ＜ 0.01)。以上 1、3、9、27、81 μmol·L－1濃度被選用于后續實驗。

2.2 流式細胞儀檢測OPCs凋亡情況對照組正常存活細胞相對數量為98.6±0.9，缺氧低糖0.5 h組為64.2±4.3(P＜0.01)，1 h組為21.5±4.8(P＜0.01)，1.5 h組為10.5±5.5(P＜ 0.01);凋亡細胞相對數量與對照組相比，缺氧低糖0.5 h組為35.1±7.6(P＜0.01)，1 h組為 76.8±17.2(P＜0.01)，1.5 h組為88.7±5.7(P ＜0.01)。見 Fig 1。

Fig 1 The proportion of apoptotic cells was determined by Annexin V-FITC/PI assay(n=3)

2.3 槲皮素對缺氧低糖損傷OPCs相對存活率和LDH漏出率的影響Fig 2表明:槲皮素能明顯提高OPCs的相對存活率，抵抗缺氧低糖損傷，Fig 3表明:槲皮素能明顯降低缺氧低糖損傷細胞LDH漏出率，間接反映槲皮素對OPCs細胞膜的保護作用。Fig 2，3都表明:同一濃度下共孵育的保護效果比預孵育更明顯(P＜0.05)，其發揮保護作用的濃度范圍分別是 3 ～81 μmol·L－1和 9 ～81 μmol·L－1，表現為劑量效應。

Fig 2 Effect of QUE on the viability of OPCs was measured by CCK-8(n=4)

Fig 3 Effect of QUE on the LDH release of OPCs was measured by LDH assay(n=4)

2.4 槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷形態學的影響81 μmol·L－1槲皮素處理 OPCs后，鏡下觀察細胞形態學變化。對照組細胞輪廓清晰，可見典型的雙極突起，橢圓形胞體邊緣有明顯光暈;缺氧低糖1.5 h后，OGD組的細胞突起全部回縮且幾乎都漂浮起來，槲皮素預孵育組細胞胞體全部回縮但漂浮率較OGD組偏低，而共孵育組仍可見部分細胞有突起存在且漂浮率明顯偏低。見Fig 4。

3 討論

Fig 4 The morphology of OPCs was observed by inverted microscope

中樞神經系統發育過程OPCs在腦中遷移并最終分化為成熟的少突膠質細胞形成髓鞘，髓鞘包裹著軸突并維持它的生理功能［8］。當某些因素導致軸突脫髓鞘后會繼發多種神經系統疾病，此時OPCs的修復作用對病情的好轉尤為重要。但是，OPCs抵抗損傷的能力有限特別是在妊娠期23～32周時缺血缺氧對其損傷尤為嚴重［9］。早產兒中患腦癱的比例比較大，這與OPCs損傷有很大關系。槲皮素具有良好的神經保護作用，已有研究發現槲皮素能夠明顯降低皮質細胞因缺氧缺糖導致的興奮毒性損傷［10］，此外，它還能保護大鼠因缺血而致的空間記憶減退和神經細胞死亡［11］。本研究發現槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷具有保護作用，這些數據進一步證明了它的神經保護作用，也為OPCs損傷保護提供了良好的藥物選擇。

Na2S2O4可以迅速制造出無氧液相環境且自身不直接損傷細胞，其模型建立效果也已得到其他實驗證實［12－13］。我們選擇了1.5 h缺氧低糖損傷模型，探討 1 ～81 μmol·L－1槲皮素對 OPCs的保護作用。共孵育和預孵育的實驗結果都證明了槲皮素可以保護OPCs細胞膜的完整性并提高其相對存活率，形態學結果進一步反映了受保護細胞的存活狀況，當細胞得到槲皮素的保護后其形態也得到一定程度的維護。同時，本實驗發現槲皮素共孵育的神經保護作用較預孵育明顯，這可能與OPCs受損后其細胞膜通透性增加，共孵育時槲皮素進入受損細胞的濃度相對增加有關。此外，槲皮素的神經保護作用表現出劑量效應，這可能與隨濃度增加其進入細胞的相對濃度增加有關。

綜上，本研究證實了槲皮素對OPCs缺氧低糖損傷有明顯的神經保護作用。這些數據為OPCs缺氧低糖損傷保護提供了初步的藥理學依據，也為深入研究槲皮素對OPCs神經保護機制提供了藥物孵育方案。

［1］ Back S A，Craig A，Kayton R J，et al.Hypoxia-ischemia preferentially triggers glutamate depletion from oligodendroglia and axons in perinatal cerebral white matter［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(2):334 －47.

［2］ Jin Y，An X，Ye Z，et al.RGS5，a hypoxia-inducible apoptotic stimulator in endothelial cells［J］.J Biol Chem，2009，284(35):23436－43.

［3］ 沈麗霞，董曉華，李 煒，等.槲皮素、補骨脂素對乳腺癌細胞株MCF-7增殖的影響［J］.中國藥理學通報，2009，25(5):601－5.

［3］ Shen L X，Dong X H，Li W，et al Effect of quercetin and psoralen on proliferation in MCF-7 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(5):601－5.

［4］ 王莉娟，龔 濤，王 麗，等.槲皮素對香煙煙霧提取物誘導的人支氣管上皮細胞死亡的抑制效應［J］.中國藥理學通報，2009，25(7):960 －3.

［4］ Wang L J，Gong T，Wang L，et al Inhibition effect of quercetin on cell death in human bronchial epithelial cells induced by cigarette smoke extract［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(7):960 － 3.

［5］ Ansari M A，Abdul H M，Joshi G，et al.Protective effect of quercetin in primary neurons against Aβ(1-42):relevance to Alzheimer's disease［J］.J Nutr Biochem，2009，20(4):269 － 75.

［6］ Bureau G，Longpre F，Martinoli M G.Resveratrol and quercetin，two natural polyphenols，reduce apoptotic neuronal cell death induced by neuroinflammation［J］.J Neurosci Res，2008，86(2):403－10.

［7］ Chen Y，Balasubramaniyan V，Peng J，et al.Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells［J］.Nat Protoc，2007，2(5):1044 －51.

［8］ Menn B，Garcia-Verdugo J M，Yaschine C，et al.Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain［J］.J Neurosci，2006，26(30):7907 －18.

［9］ Back S A，Han B H，Luo N L，et al.Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia［J］.J Neurosci，2002，22(2):455 －63.

［10］ Ha H J，Kwon Y S，Park S M，et al.Quercetin attenuates oxygenglucose deprivation and excitotoxin-induced neurotoxicity in primary cortical cell cultures［J］.Biol Pharm Bull，2003，26(4):544 －6.

［11］ Pu F，Mishima K，Irie K，et al Neuroprotective effects of quercetin and rutin on spatial memory impairment in an 8-arm radial maze task and neuronal death induced by repeated cerebral ischemia in rats［J］.J Pharmacol Sci，2007，104(4):329 － 34.

［12］ Liu J，Kam K W，Zhou J J，et al Effects of heat shock protein 70 activation by metabolic inhibition preconditioning or kappa-opioid receptor stimulation on Ca2+homeostasis in rat ventricular myo-cytes subjected to ischemic insults［J］.J Pharmacol Exp Ther，2004，310(2):606 －13.

［13］ Abudara V，Jiang R G，Eyzaguirre C.Behavior of junction channels between rat glomus cells during normoxia and hypoxia［J］.J Neurophysiol，2002，88(2):639 －49.