類風濕關節炎大鼠模型的相關細胞因子研究

李 穎，劉英娜，覃仕化，楊俊生，冷冬妮，王 珺，杜秀鑾，汪 悅

類風濕性關節炎(rheumatic arthritis，RA)是一種臨床常見的疾病，是一種不明原因的慢性炎性多系統性自身免疫性疾病，RA 患者的關節囊和關節周圍韌帶組織的攣縮、變形是影響RA 患者關節置換后功能康復的重要原因［1］。本研究通過牛Ⅱ型膠原(CⅡ)誘導的大鼠關節炎模型的韌帶及關節囊組織的病理觀察和相關細胞因子的研究，探討大鼠類風濕性關節炎動物模型(CIA)中的韌帶組織的浸潤機制及不同時期的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)的變化趨勢。

1 材料與方法

1.1 材料 Wister 大鼠90 只(上海斯萊克公司提供)，體重180 ～220 g，8 周齡左右，雌雄各半，常規條件飼養。隨機分成三組:正常組、CIA 組、加強CIA 組各30 只。

1.2 配置CⅡ乳劑 用0.1 ml/L 的冰醋酸先溶解CⅡ，濃度為4 mg/ml，放置4℃冰箱過夜，與弗氏完全佐劑(上海sigma 醫學試劑有限公司)等體積混合，震蕩乳化制成CⅡ乳劑，置于4℃冰箱保存。

1.3 造模 將配置好的CⅡ乳劑以0.1 ml/只的劑量注射于大鼠的左足底，加強CIA 組于1 周后原部位再次注射同樣劑量CⅡ乳劑。

1.4 取材 分別于最后一次注射后的第10 天、20天、30 天，分三次處死大鼠，取踝關節的韌帶和關節囊組織，將所取組織分成兩份，分別行組織勻漿和病理檢查。

1.5 組織勻漿的方法 取新鮮組織洗凈擦拭干凈后立即放入－70℃冰箱中冷凍保存，以備勻漿。勻漿方法如下:稱取一定量的組織，以生理鹽水(生理鹽水的體積總量為組織塊重量的9 倍)混合，倒入勻漿管中充分研碎，使組織勻漿化后，于4℃，3000 r/min 離心10 ～15 min，吸取上清液裝入EP 管，放入－70℃冰箱冷凍保存，待檢。

1.6 病理檢查 取組織標本，以4%中性甲醛固定，常規檢查。

1.7 檢測 對于1.5 步驟所取組織勻漿液，分別用ELISA(上海韻涵生物科技有限公司)試劑盒檢測IL-2 和TNF-α 水平。

1.8 統計學處理 檢測數據采用SPSS 13.0 軟件分析處理，計量資料采用均數±標準差)表示，組間比較采用成組t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 光鏡下觀察 CIA 模型大鼠的韌帶組織病理切片中可見大片炎性滲出及壞死、肉芽組織形成、周圍血管擴張、充血、大量淋巴細胞、中性粒細胞及漿細胞浸潤。加強組的血管擴張及淋巴細胞浸潤程度較未加強組高，可見淋巴濾泡與纖維素滲出、膠原纖維沉著及纖維素樣壞死。見圖1 ～3。

2.2 大鼠踝關節組織勻漿IL-2 與TNFL-α 檢測結果 CIA 組與加強CIA 組的同期IL-2 及TNF-α 濃度均顯著高于正常組，差異具有統計學意義(P ＜0.05)，其中尤以加強CIA 組的表達最高。CIA 組與加強CIA 組中期的IL-2 與TNF-α 的濃度也顯著分別高于同組的早、晚期，差異也均有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 CIA 組:關節滑膜組織較多淋巴細胞、漿細胞浸潤(HE ×40)

圖2 加強CIA 組:較多淋巴細胞浸潤并見淋巴濾泡形成(HE ×40)

圖3 加強CIA 組:肉芽組織形成伴組織細胞增生、多核巨細胞反應(HE ×40)

表1 大鼠踝關節組織勻漿IL-2 與TNF-α 濃度檢測結果(ng/L，n=10)

表1 大鼠踝關節組織勻漿IL-2 與TNF-α 濃度檢測結果(ng/L，n=10)

注:與正常組同期比較，*P ＜0.05;與本組早、晚期比較，△P ＜0.05

IL-2TNF-α時間正常組 CIA 組 加強CIA組 正常組 CIA 組 加強CIA組早期 646.2±50.7 772.0±45.9* 961.6±50.2* 115.02±3.49 159.69±7.09 195.32±5.73*中期 584.8±25.8 890.8±53.2＊△ 1110.8±56.2＊△ 123.44±3.52 210.47±1.33△ 216.10±2.62＊△晚期 644.0±24.8 802.2±71.8* 1015.8±54.7* 126.48±1.52 173.98±4.95 200.40±2.64*

3 討 論

RA 是一種不明原因的慢性炎性多系統性自身免疫性疾病，病變的特征是持續性進行性的滑膜炎，通常累及對稱的周圍關節［2］?；ぱ啄芤疖浌瞧茐?，繼而引起關節畸形而成為該病的標志［3］。RA患者的關節囊和關節周圍韌帶組織的攣縮、變形是RA 患者關節畸形、功能障礙的重要原因之一［4］?，F代關節外科的技術日漸成熟，RA 對于滑膜和骨組織的破壞，使用外科技術可以獲得滿意的糾治，但是韌帶和關節囊組織的攣縮變形仍是影響關節置換術后的患者功能康復的重要因素之一［5］。RA 患者的自然病情遷延較長，很難觀察到完整的關節囊及韌帶組織病變的過程。研究證實［6］，RA 患者血清及滑膜液中存在抗膠原抗體，這種對膠原組織的自身免疫反應，可以解釋其具有的系統性和慢性持續性發展的特點。CIA 的病理改變表現為關節滑膜的T 細胞、B 細胞的增生、浸潤，能夠較好的反映RA 的韌帶及關節囊的浸潤機制，是研究治療RA 的較理想的模型。

研究表明:RA 患者病理切片亦證實了其韌帶與關節囊的浸潤過程與血管擴張后的慢性炎性浸潤相關。TNF-α 作為一個公認的炎性因子［7］，廣泛的作用于炎性浸潤的各個過程，在炎性反應的局部組織中有較高的表達，在RA 患者滑膜液中其表達也較高。TNF-α 在RA 病變中的主要作用［8］:①為強有力的骨吸收刺激劑，其作用是PG 依賴性的，并可抑制骨膠原合成。②刺激成纖維細胞增殖，刺激成纖維細胞和軟骨細胞產生PGE2和膠原酶，刺激軟骨細胞分泌金屬蛋白酶，促進軟骨破壞。③升高纖維蛋白溶酶激活劑的濃度。④增加滑膜內皮細胞合成纖維細胞生長因子的釋放，促進新血管的形成，這是血管翳增生的一個重要的早期特征。⑤調節其他細胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)的產生。IL-2 作為T 淋巴細胞活性的標志性因子，反映了T 淋巴細胞的功能水平，具有免疫增強和免疫調節作用，在RA 發病急性期IL-2 水平增高，促進炎癥發展。

本研究重點關注RA 的韌帶及關節囊組織的病變過程，CIA 模型大鼠的韌帶及關節組織的病理變化反映了這種變化趨勢，組織勻漿中的TNF-α 和IL-2 的水平變化也驗證以上結論。實驗中發現CIA組與加強CIA 組在20 d 左右的細胞因子水平最高，隨后則顯現出CIA 模型大鼠炎性過程的自限性趨勢。有文獻指出TNF-α 和IL-2 的表達水平波動幅度較大，我們考慮這可能與實驗方法的不同、免疫劑量的不同、注射及加強方法的差異、組織取材的時間以及檢測試劑盒選擇不同有關。CIA 造模的標準實驗方法，有待在大樣本量的實驗基礎上統一。CIA大鼠的病理切片主要的形態特點是炎性細胞的彌漫性浸潤，與人的病理切片顯示炎細胞浸潤主要是以血管擴張，圍繞血管為中心的炎性浸潤方式有一定的區別，這種區別主要因發病機制不同而異，對于炎性轉歸有無影響有待進一步的研究。

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