用改良Hodge 試驗檢測產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌

楊 燕，孫長貴，陳 堅，熊 敏，成 軍

碳青霉烯類抗生素為廣譜β-內酰胺類抗生素，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有很強的抗菌活性，屬于繁殖期殺菌劑，對多種β-內酰胺酶高度穩定，在臨床上大部分被用于多重耐藥菌株引起的嚴重感染，尤其用于產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)和(或)去阻遏表達β-內酰胺酶(AmpC)的革蘭陰性桿菌引起的感染的治療［1］。近年來，碳青酶烯類抗生素耐藥腸桿菌科細菌所致感染爆發的報道呈現上升趨勢［2-3］，給抗感染治療帶來重大挑戰［4］。碳青酶烯類抗生素的耐藥機制之一是與菌株產生碳青霉烯酶有關，碳青霉烯酶不僅能水解碳青霉烯類抗生素，對其他β-內酰胺類抗生素也具有水解作用。產生該類酶的菌株藥敏試驗理論上應表現對碳青霉烯藥物耐藥，但事實上，有部分產酶菌株可表現敏感，此種情況尤其在自動化檢測體系中易被忽視，從而導致治療失敗。為了解臨床分離的腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶情況，我們用改良的Hodge 試驗對碳青霉烯類抗生素敏感折點附近的腸桿菌科細菌進行碳青霉烯酶檢測，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株 390 株腸桿菌科細菌為我院2005 年6月至2008 年6 月從臨床送檢標本中分離所得。其中大腸埃希菌237 株、克雷伯菌51 株、腸桿菌27株、變形桿菌48 株、枸櫞酸桿菌3 株、沙雷菌24 株;無重復分離菌株。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 和產TEM-5 型肺炎克雷伯菌。

1.2 試劑 MH 瓊脂為杭州天和微生物試劑公司產品。美羅培南、厄他培南、氨曲南、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、阿米卡星、妥布霉素和環丙沙星紙片為Oxoid 公司產品。GNI 細菌鑒定卡為生物梅里埃公司產品。

1.3 儀器設備 Vitek 32 全自動微生物鑒定儀為生物梅里埃公司產品，PHW-165Q 型恒溫培養箱為寧波自動化儀表研究所產品。

1.4 藥物敏感性試驗及待測菌株的篩選 使用標準的K-B 紙片瓊脂擴散法檢測腸桿菌科細菌對兩種碳青霉烯類抗生素的耐藥性。按照CLSI(美國臨床和實驗室標準化協會)M100-S19 文件推薦，篩選厄他培南抑菌圈直徑在19 ～21 mm 或美羅培南抑菌圈直徑在16 ～21 mm 的腸桿菌科細菌，進行改良Hodge 試驗。

1.5 改良的Hodge 試驗(MHT)［5］將10 倍稀釋的0.5 麥氏濁度大腸埃希菌ATCC 25922 懸液均勻涂布于MH 瓊脂平板，使平板干燥3 ～10 min，于平板中央貼一片厄他培南或美羅培南紙片。用10 μl接種環或拭子，挑取血瓊脂平板過夜生長的3 ～5 個待測菌菌落或質量控制菌株懸液，從紙片邊緣到平板邊緣的方向劃直線接種。劃線至少有20 ～25 mm長。35℃培養16 ～20 h。若待測菌產生碳青霉烯酶，其接種線與大腸埃希菌ATCC 25922 抑菌環交界處會產生朝向抑菌圈內增強生長現象，即MHT 陽性;反之則為陰性。見圖1。

圖1 改良Hodge 試驗結果

1.6 ESBLs 檢測 采用CLSI M100-S19 文件推薦方法［5］。

1.7 質量控制 用大腸埃希菌ATCC 25922 進行常規紙片擴散法藥敏試驗質量控制，兩種碳青霉烯類抗生素對質控菌株的抑菌環結果均在CLSI 的允許范圍內。改良的Hodge 試驗質量控制，用MHT 陽性菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 和MHT 陰性菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 進行。

2 結 果

2.1 藥敏試驗篩選結果 K-B 紙片瓊脂擴散法檢測390 株腸桿菌科細菌，篩選得到厄他培南抑菌環直徑在19 ～21 mm 或美羅培南抑菌環直徑在16 ～21 mm 的腸桿菌科細菌55 株，其中大腸埃希菌22株，克雷伯菌12 株，腸桿菌10 株，變形桿菌9 株，沙雷菌2 株。

2.2 改良Hodge 試驗結果 55 株待測菌株，MHT陽性12 株，其中大腸埃希菌9 株，陰溝腸桿菌2 株，肺炎克雷伯菌1 株。MHT 陽性菌株的碳青霉烯類抗生素抑菌圈直徑結果見表1。

表1 MHT 陽性菌株碳青霉烯類抗生素抑菌圈直徑(mm)

2.3 MHT 陽性菌株藥敏試驗結果及產生ESBL 情況 12 株MHT 陽性菌株均產ESBL;對部分抗生素敏感試驗結果見表2。

3 討 論

碳青霉烯酶是具有強大水解能力的β-內酰胺酶，能水解青霉素、頭孢菌素、單環內酰胺類及碳青霉烯類抗生素。碳青霉烯酶屬于Ambler 分子分類法的A 類、B 類和D 類β-內酰胺酶。A 類和D 類酶的活性部位具有絲氨酸;B 類酶即金屬β-內酰胺酶，其活性部位具有鋅離子。A 類酶包括陰溝腸桿菌的IMI 21 和NMC 2A 酶、粘質沙雷菌中由染色體介導的NMC 2A、Sme 21、Sme 22、Sme 23、IMI 21 酶，以及肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌中質粒介導的KPC 1、GES 22 酶。其中以肺炎克雷伯菌KPC 酶傳播最廣，多見于腸桿菌科細菌，最早分離于肺炎克雷伯菌，由質粒編碼介導。A 類酶可被克拉維酸和他唑巴坦等β-內酰胺抗生素所抑制。D 類酶由OXA型酶組成，多見于鮑曼不動桿菌。金屬酶多見于銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動桿菌和沙雷菌等［2］。

表2 部分抗菌藥物對MHT 陽性菌株的抑菌圈直徑(mm)

本研究根據CLSI 推薦［5］，選擇厄他培南抑菌環在19 ～21mm 或美羅培南抑菌環在16 ～21mm 的腸桿菌科細菌作為待測菌，旨在檢出表型試驗敏感而非耐藥的產酶菌株，以確保藥敏試驗結果準確，為臨床正確用藥提供依據。從本研究MHT 陽性結果來看，符合厄他培南篩選條件的MHT 陽性株占總陽性株的83.33%(10/12)，符合美羅培南篩選條件的MHT 陽性株占總陽性株的25%(3/12)。提示厄他培南篩選的指示效果高于美羅培南，臨床實驗室應盡可能考慮用厄他培南紙片進行篩選試驗。

研究結果表明，我院腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶以大腸埃希菌較為多見，占MHT 陽性菌的75%(9/12)，其次為陰溝腸桿菌和肺炎克雷伯菌。因此，臨床實驗室應在進行常規藥敏試驗時，應加強對這類菌株產碳青霉烯酶的監測。

本次研究中改良Hodge 試驗陽性的菌株均產ESBL。由于碳青霉烯類抗生素為治療產ESBL 腸桿菌科細菌引起的嚴重感染的一線藥物［6］，所以臨床實驗室對ESBL 陽性菌進行改良Hodge 試驗檢測其是否產碳青霉烯酶很重要。

對于MHT 陽性而對碳青霉烯類抗生素表型試驗敏感的腸桿菌科細菌，CLSI 建議在報告結果前，應執行MIC 試驗，如對任一種碳青霉烯類藥物敏感(厄他培南MIC≤2 μg/ml、美羅培南MIC≤4 μg/ml或亞胺培南MIC≤4 μg/ml)，只報告碳青霉烯類藥物的MIC，無需解釋結果。報告中可作如下注釋，“此菌株被證明產碳青霉烯酶。用碳青霉烯類藥物治療藥敏試驗對碳青霉烯類藥物敏感但體外試驗證明產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌引起的感染，其臨床療效尚不明確?！?/p>

抗生素是臨床治療感染性疾病的最有力武器［7］，抗生素的濫用導致耐藥菌株日趨增多、耐藥程度日趨增強，迫使我們需要進一步合理使用抗生素。以亞胺培南和美羅培南為代表的碳青霉烯類抗生素為治療重度感染的一線經驗治療藥物［8］，然而碳青霉烯類抗生素藥敏試驗敏感但產碳青霉烯酶的菌株引起的臨床感染，給臨床治療帶來較大的困擾。臨床微生物學實驗室應建立測試碳青霉烯酶方法，及時準確的報告結果。

改良的Hodge 試驗，可用于檢測碳青酶烯類抗生素敏感的菌株產碳青酶烯酶的情況，在檢測腸桿菌科細菌時具有90%以上的敏感性和特異性［5］，但此法為一種表型試驗，不能將碳青霉烯酶分型。對于MHT 試驗陽性菌株的基因分型，還有賴于PCR進行基因檢測。

［1］ Peirano G，Seki LM，Passos VLV，et al.Carbapenem-hydrolysing β-lactamase KPC-2 in Klebsiella pneumoniae isolated in Rio de Janeiro，Brazil［J］.Antimicrob Chemother，2009，63(2):265-268.

［2］ Queenan AM，Bush K.Carbapenemases:the versatile beta-lactamases［J］.Clin Microbiol Rev，2007，20(3):440-458.

［3］ Schwaber MJ，Klarfeld-Lidji S，Navon-Venezia S，et al.Predictors of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae acquisition among hospitalized adults and effect of acquisition on mortality［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(3):1028-1033.

［4］ Schwaber MJ，Carmeli Y.Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae:a potential threat［J］.JAMA，2008，300(24):2911-2913.

［5］ CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，Nineteenth informational supplement.CLSI document M100-S19［S］.Wayne，PA:Clinical and Laboratory Standards Institute，2009，29(3):1-149.

［6］ Paterson DL.Recommendation for treatment of severe infections caused by Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases(ESBLs)［J］.Clin Microbiol Infect，2000，6(9):460-463.

［7］ 王菁平，丁蓉蓉.試論醫務人員合理用藥［J］.東南國防醫藥，2009，11(4):353-355.

［8］ 夏 云，曹 何，張曉恒，等.革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗生素耐藥率的變化及用量的關系［J］.臨床檢驗雜志，2010，28(3):237-238.