10個玉米品種間過氧化物同工酶的研究

王世華，高雙成，郝轉芳，施 江，付國占

(1.河南科技大學農學院，河南洛陽471003;2.中國農業科學院作物科學研究所，北京100081)

0 前言

同工酶的形成是生物體基因結構差異造成的，在進化過程中有一定的保守性［1］。同工酶是基因和性狀的連接物，具有明顯的種屬、組織和發育階段的特異性，既是生理指標，又是可靠的遺傳標志［2］。同工酶技術，是通過凝膠電泳的方法，將不同的同工酶酶帶分離開，經過染色形成酶帶譜，在遺傳育種、生長發育、物種起源等領域的成為一種重要的研究工具，也可作為鑒定生物基因型是否有差異的可靠指標［3－5］。最早將同工酶應用于玉米雜種研究的是Schwartz，他發現了雜交后代中有新的酶帶表達(稱為雜交酶)，并試圖把它和雜種優勢聯系起來［6］。中國科技工作者利用非變性不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，研究了過氧化物酶、酯酶等同工酶與玉米雜種優勢的關系［7－10］，極大地推動了同工酶在玉米雜種優勢預測和優良品種選育上的應用。目前，國內做同工酶研究的較多，劉正蒙利用酯酶同工酶測定了25個玉米自交系的酶譜距離，對組合間酶譜距離與其籽粒產量雜種優勢進行了相關分析，二者呈顯著相關［11］。劉新文等通過在玉米不同發育階段選取不同部位組織樣品，進行POD和EST同工酶的電泳分析，發現不同發育階段不同部位組織樣品，其同工酶帶數與活性是不同的，從而可以將11種多胞質系區分開來［12］。但研究特用玉米(甜玉米、糯玉米)和普通玉米的親緣關系還較少，本文用聚丙烯酰胺電泳技術對玉米幼苗進行了過氧化物同工酶分析，采用計算聯合系數的方法，鑒定了10個玉米品種間的親緣關系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以中國選育并審定登記的10個玉米品種為供試材料，其編號分別為Y1:贛新花糯1號;Y2:豫禾988;Y3:渝彩甜糯1號;Y4:臺灣超甜38號;Y5:滑玉12;Y6:美糯2號;Y7:張玉9號;Y8:洛陽800;Y9:沈單16;Y10:魯單981。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶液制備

取10個玉米品種的種子各20粒，分別播種于沙床，培養至長出2片幼葉，每品種分別稱取幼葉各0.1 g，加0.3 mL提取液(0.2 mol/L的PBS，pH 7.0)，置冰浴中研磨至勻漿，4℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液置－4℃冰箱中貯存備用。

1.2.2 制膠及電泳

制膠時所用的分離膠質量分數為7.5%(pH 8.9)，濃縮膠質量分數為4%(pH 6.8)。電極緩沖液為Tris-Gly系統(pH 8.3)，指示劑為溴酚藍，點樣量為30μL，開始穩壓100～150 V，當溴酚藍進入分離膠和濃縮膠交界處時，電壓加大到200～250 V，低溫電泳約4 h。

1.2.3 染色

過氧化物同工酶染色液［13］:5 mL的2%聯苯胺醋酸溶液(2 g聯苯胺溶于18 mL冰乙酸中，加水72 mL)和2 mL的3%H2O2，加蒸餾水93 mL。

電泳完畢取下凝膠置于染色液中染色5～10 min，待酶帶清晰可見后用蒸餾水漂洗后觀察結果并照相記錄。

2 結果與分析

2.1 10個玉米品種間過氧化物同工酶分析

按相對遷移率Rf值繪制模式圖并標定酶帶位置。Rf=酶帶移動的距離/前沿指示劑(溴酚藍)移動的距離。經電泳分析供試的10個玉米品種的過氧化物同工酶酶譜可以歸為若干酶譜類型，將所有的酶譜排在一起，總共分離出36條酶帶，按其電泳遷移率(Rf)集中程度由負極向正極可分為A、B、C三個區，各品種的過氧化物同工酶酶帶數為2～ 6條，遷移率在0.075～0.457之間變化(見圖1)。其中，A區為近陰極端的慢速遷移區，Rf=0.075;B區為中速遷移區，Rf=0.161～0.226;C區為近陽極端的快速遷移區，Rf=0.441～0.457。從10個品種間酶帶來看，Y1、Y2、Y5和Y7的酶帶大致相同，都只有3條帶，位置相同，但酶帶活性各異。Y3和Y6的酶帶數相同，位置也一樣，酶帶活性有差別。酶帶數最多的品種是Y8和Y9，都是6條酶帶，酶帶位置都相同，僅在活性方面有差別。酶帶數最少的是Y4和Y10，均只有2條酶帶。

圖1 玉米10個品種間過氧化物同工酶模式圖

從表1可知:10個玉米品種間過氧化物同工酶酶譜也具有一定的差異，主要表現在酶帶數、酶帶遷移率與酶活性上面。A、B、C三個區都有各自的公共帶，其中A區的公共帶Rf=0.075，B區的公共帶Rf=0.161，C區的公共帶Rf=0.441。

表1 玉米10個品種間過氧化物同工酶相對遷移率(Rf)

2.2 10個玉米品種間親緣關系的分析

玉米品種間親緣關系的分析主要是通過任何兩個玉米品種間聯合系數(S)的比較得出，聯合系數的數值大小直接反映出親緣關系的遠近。根據任何2個品種同工酶酶譜的條帶估算，可得出任何2個玉米品種之間的聯合系數(S)［14］。S=(兩個品種之間共有的酶帶)/［(兩個品種所具有的酶帶數之和)－(共有的酶帶數)］，聯合系數在0～1之間，聯合系數愈小，說明兩個品種間親緣關系愈遠。

從表2可看出:Y4和Y8、Y9之間以及Y10和Y8、Y9之間過氧化物同工酶的聯合系數(S)都最小，均為0.333，說明它們的親緣關系較遠。

Y1和Y2、Y5、Y7之間過氧化物酶同工酶的聯合系數為1.000，說明它們之間的親緣關系較近;Y4和Y10之間過氧化物酶同工酶的聯合系數為1.000，說明它們的親緣關系較近;Y8和Y9之間的過氧化物酶同工酶的聯合系數也為1.000，可見二者的親緣關系也十分相近。其余品種的親緣關系，通過過氧化物酶同工酶的聯合系數得出，聯合系數越小，品種間的差異越大，親緣關系越遠。

表2 玉米10個品種間過氧化物酶同工酶的聯合系數(S)

3 結論

通過對10個玉米品種的過氧化物同工酶酶譜分析，總共分離出36條酶帶，按其電泳遷移率(Rf)集中程度由負極向正極可分為A、B、C三個區。其中，A區的公共帶Rf=0.075;B區的公共帶Rf=0.161; C區的公共帶Rf=0.441。各品種的過氧化物同工酶酶帶數為2～6條，遷移率在0.075～0.457之間變化。對10個玉米品種親緣關系進行分析，并研究它們的遺傳相似程度，研究發現臺灣超甜38號與洛陽800、沈單16的親緣關系最遠，而滑玉12與張玉9號的親緣關系比較近，洛陽800與沈單16具有非常近的親緣關系。

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