激素聯合丙種球蛋白治療多發性硬化的臨床研究

孟慶萍，王嘉俊，馮 娟*，焦彥嶺，潘 月

多發性硬化(MS)是一種炎性反應性疾病，以中樞神經系統的脫髓鞘損害為主［1-3］，主要臨床特點為中樞神經系統白質散在分布的多病灶與病程中呈現的緩解復發，癥狀和體征的空間多發性和病程的時間多發性［4］。其病因及發病機制尚不明確。有研究顯示，MS患者免疫調節機制存在異常，免疫球蛋白可通過非特異性的免疫調節機制調節機體的免疫功能［5］。本研究采用激素聯用丙種球蛋白治療MS患者，取得了良好的效果，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 一般資料 41例均為遼寧省內各醫院2006年2月-2010年12月門診與住院患者，臨床診斷均符合McDonald診斷標準。根據臨床表現、體征以及影像學檢查和電生理檢查，確定:①中樞神經系統白質內有2處或2處以上的病灶;②病程中有2次或2次以上的緩解復發史，其間歇期在1個月以上，每次復發持續時間在24 h以上;③研究前基礎EDSS評分在0～4.5之間;④發病年齡為17～60歲;⑤排除標準:臨床孤立綜合征(CIS);進行性的MS;在研究過程中伴有臨床復發的MS患者。將病例隨機分成2組。聯合治療組20例，男9例，女11例，年齡17～59歲，平均年齡36歲;對照組21例，男10例，女11例，年齡18～60歲，平均年齡35歲。

1.2 研究方法

1.2.1 給藥方法 兩組患者均接受激素治療，急性活動期用甲基強的松龍1 g/d加入500 mL生理鹽水中靜脈滴注，連用3 d后，減量至500 mg/d加入500 mL生理鹽水中靜脈滴注，連用3 d后，減量至250 mg/d加入250 mL生理鹽水中靜脈滴注，再連用3 d后，減量至120 mg/d加入250 mL生理鹽水中靜脈滴注，繼續連用3 d，然后改為口服潑尼松60 mg/d，4～6周逐漸減量至停藥。同時應用胃黏膜保護劑。聯合治療組加用丙種球蛋白0.4 g/kg靜脈注射，每日1次，連續治療5 d。所有患者在治療前和開始治療后的3周，均檢測臨床及免疫學的變量。

1.2.2 神經學評估 參照Kurtzke神經功能障礙量表(EDSS)［6］，兩組患者治療前和開始治療后的3周分別應用EDSS量表評估1次。

1.2.3 免疫方面的檢測 外周血單核細胞(PBMC)通過Ficoll-Isopaque進行分離，血樣被1∶1稀釋在RPMI 1640培養基中(其中包含有5 mM HEPES，100 U/mL的盤尼西林，100 g/mL的鏈霉素)。稀釋后密度梯度離心法分離PBMC，然后在含有10%的熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI中進行洗滌。通過臺盼藍拒染法計數存活細胞的數量。這些細胞在加有10%的FBS的RPMI中進行再懸浮，然后用于細胞因子的測定和分析。

1.2.4 外周血單核細胞的增殖 PBMC(外周血單核細胞)的增殖是通過MTT分析方法進行的。3×103個 PBMC，在200 μL同時加有 10%FBS 的RPMI 1640培養基中，用1 μg/mL的聚羥基脂肪酸酯(PHA)進行處理，接種于96孔培養板(200 μL/孔)。平板在5%CO2、溫度為37℃條件下孵育 72 h，加入 20 μL 的 5 mg/mL MTT，孵育 4 h。離心后，棄去中層物質，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO)。在540 nm處分別讀取刺激和非刺激組細胞的光密度(OD)值。通過MTT比色法檢測細胞增殖，用“平均刺激指數(SI)”表示，SI=OD(刺激組細胞)/OD(非刺激組細胞)。

1.2.5 細胞因子的分析 密度為2×106/mL的PBMC(外周單核細胞)在1 mL伴有和不伴有PHA(1 μg/mL)的培養基中各孵育1次，然后在細胞培養條件下培養72 h，收集上清液，采用ELISA方法定量分析IFN-γ、IL-10的水平。每個樣本分為2份，利用全自動定量繪圖酶標儀測定405 nm和650 nm下吸光度。IFN-γ、IL-10的敏感度分別為2、4.1 pg/mL。兩組于治療前開始、治療后3周均取肘靜脈血3 mL，用酶聯免疫吸附法檢測血清IL-6的水平。

1.3 統計學分析 應用SPSS15.0統計軟件，數據通過中位數的百分比(95%的可信區間)表示。計數資料數據用±s表示，計量資料用t檢驗，檢驗水準=0.05;Mann-Whitney檢驗用于兩組的中位數的比較，Wilcoxon檢驗用于連續變量的分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床預后 激素聯合丙球治療組(聯合組)和單純應用激素治療組(對照組)患者的性別、年齡及治療前的EDSS評分差異均無統計學意義(P＞0.05，見表1)。聯合組治療后EDSS評分與治療前相比，差異有統計學意義，聯合組治療前后EDSS的變化量與對照組治療前后EDSS的變化量相比，差異有統計學意義(P＜0.05，見表1)。

表1 治療前后兩組EDSS評分比較

2.2 T細胞的功能 治療前兩組患者的刺激指數(Stimulation index，SI)差異無統計學意義。治療后聯合組的SI顯著低于對照組(P＜0.05)，聯合組治療前后SI差異具有統計學意義(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 治療前后兩組的刺激指數(SI)注:治療前后比較，P＜0.05

2.3 細胞因子IFN-γ和IL-10的檢測結果 治療前，聯合組與對照組相比，任何細胞因子的基礎水平差異無統計學意義(見表2)。兩組治療后，IFN-γ的水平均顯著降低(P＜0.05)，治療后聯合組與對照組相比，IFN-γ的水平亦顯著降低(P＜0.05)。治療后聯合組IL-10的水平較治療前顯著增加(P＜0.05)，其IL-10的水平明顯高于對照組(P＜0.05)，對照組在治療前后的IL-10水平差異無統計學意義(見表2)。

表2 治療前后兩組IFN-γ和IL-10濃度比較(ρg/mL，±s)

表2 治療前后兩組IFN-γ和IL-10濃度比較(ρg/mL，±s)

注:與同組治療前比較，*P＜0.05，#P＞0.05;與對照組比較，▲P＜0.05

聯合組(n=20)治療前 治療后對照組(n=21)治療前 治療后IFN-γ 2 157±248 987±134＊▲ 2 198±150 1 564±130*IL-10 3 845±3304 736±450＊▲ 3 516±314 4 080±423#

2.4 細胞因子IL-6的檢測結果 聯合組治療后與同組治療前、對照組治療后IL-6的水平差異具有統計學意義(P＜0.05，見表3)。

表3 兩組治療前后血清IL-6變化(±s)

表3 兩組治療前后血清IL-6變化(±s)

注:與同組治療前比較，*P＜0.05;與對照組比較，#P＜0.05

聯合組(n=20)治療前 治療后對照組(n=21)治療前 治療后IL-6(g/L) 235.43±40.35 16.62±6.51* 236.36±41.42 23.46±9.63*

3 討論

多發性硬化是一種主要由細胞介導的中樞神經系統白質的自身免疫性疾病，免疫功能喪失或免疫平衡失調是其主要病理機制。有證據表明，髓鞘特異性自身反應性T細胞的活化是多發性硬化的重要發病機制?；罨疶細胞分泌Th1/Th2兩種類型的細胞因子。研究發現，在多發性硬化急性期，Th1型細胞因子明顯增加，而Th2型細胞因子分泌量很少，緩解期正好相反［7］，提示 Th1/Th2平衡對于多發性硬化病情的發展和轉歸極其重要。目前較多研究認為，Th1細胞因子能加重多發性硬化病情，而Th2細胞因子則有助于病情緩解及康復［8］。其中 Th1類細胞因子主要包括 IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12 等，而 Th2 細胞因子包括 IL-4、IL-10等。因此，降低Th1類細胞因子、升高Th2類細胞因子的干預方法，可能會改善多發性硬化患者的癥狀。

短期內高血藥濃度的甲潑尼龍對人體神經系統有強烈的非特異性免疫抑制作用［9］，可快速減輕急性脫髓鞘病變組織的炎癥和水腫，較快逆轉神經傳導阻滯［10］，改善脫髓鞘區神經傳導功能［11］。從而降低多發性硬化患者 EDSS評分，改善患者癥狀。

丙種球蛋白具有免疫調節功能。本文結果顯示，激素聯合丙種球蛋白治療組可顯著降低IFN-γ、IL-6的水平，升高IL-10的水平;單純應用激素治療組亦可明顯降低IFN-γ的水平，但治療后激素聯合丙種球蛋白治療組與單純應用激素治療組比較，IFN-γ水平的降低更加顯著。亦有報道顯示，丙種球蛋白可抑制致病性細胞因子，Ig Fab能特異性結合 IL-1a、IL-2、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ，阻止細胞因子與相應受體結合，抑制細胞因子的生物學活性［12］，從而實現調節免疫、治療自身免疫性疾病的作用。丙種球蛋白具有抑制體外T細胞增殖及細胞因子產生的作用，這些細胞因子包括IL-2、TNF-β、IFN-γ［13］和 IL-6［14］;升高 IL-10 的水平［15］。

總之，激素和丙種球蛋白對多發性硬化的治療均有療效，兩者聯合治療多發性硬化的療效優于單純應用激素組，起到雙重的免疫調節作用。激素治療多發性硬化可通過非特異性免疫抑制作用而實現，丙種球蛋白可增加抗炎細胞因子的水平，降低炎性細胞因子的水平，而實現免疫調節的作用，降低多發性硬化患者的EDSS評分，改善患者癥狀。靜脈注射丙種球蛋白后所導致的IFN-γ、IL-6降低和IL-10濃度的增加，提示靜脈注射丙種球蛋白可通過調節抗炎細胞因子和炎性細胞因子的水平對多發性硬化的異常免疫應答起調節作用，有效改善患者癥狀。

［1］ Korn T.Pathophysiology of multiple sclerosis［J］.Neurol，2008，255(S)16:2-6.

［2］ 毛悅時，呂傳真.多發性硬化的臨床、磁共振成像及誘發電位的綜合研究［J］.中國臨床醫學，2005，12(1):32-33.

［3］ 梁活，曾麗.小膠質細胞與多發性硬化［J］.實用醫學雜志，2010，26(5):873-875.

［4］ 賈建平.神經病學［M］.第6版.北京:人民衛生出版社，2008:258-264.

［5］ Achiron R，Gilad R，Margalit，et al.Intravenous gammaglobulin treatment in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis:delineation of usage and mode of action［J］.Journal of Neurology，Neurosurgery，and Psychiatry，1994，57(S):57-61.

［6］ Wellek A，Korsukewitz C，Bach JP，et al.Sibling disability risk at onset and during disease progression in familial multiple sclerosis［J］.Mult Scler，2011 May 11［Epub ahead of print］

［7］ Thompson RF，Davenport J.Cellular immunity in multiple sclerosis.Implications for pathogenesis and treatment［J］.Mo Med，1984，81(10):669-673.

［8］ Rodriguez Sainz，Mdel C，Sanchez Ramon S.Th1/Th2 cytokine balance and nitric oxide in cerebrospinal fluid and serum from patients with multiple sclerosis［J］.Eur Cytokine Netw ，2002，13(1):110-114.

［9］ 馮雪梅，李瞿，馮娟.大劑量甲潑尼龍沖擊治療多發性硬化的觀察［J］.實用藥物與臨床，2009，12(3):221-222.

［10］ 李瞿，張朝東.甲潑尼龍與丙種球蛋白聯合治療成人急性播散性腦脊髓炎的療效［J］.實用藥物與臨床，2009，12(5):365-366.

［11］ 張文洛，戚曉昆.大劑量甲潑尼龍沖擊聯合丙種球蛋白治療重癥脫髓鞘腦病2例［J］.海軍總醫院學報，2007，1(20):60-61.

［12］ 陳同辛，談珍.靜脈人血丙種球蛋白在自身免疫性疾病中的應用［J］.實用兒科臨床雜志，2009，24(9):643-645.

［13］ Skansén-Saphir U，Andersson J，Bj?rk L，et al.Down-regulation of lymphokine synthesis by intravenous gammaglobulin is dependent upon accessory cells［J］.Scand J Immunol，1998，47(3):229-235.

［14］ 李德亮，宋雪民，李繼華，等.丙種球蛋白對感染性疾病患兒血清 IL-6 的影響［J］.山東醫藥，2009，49(21):103.

［15］ Kasztalska K，Ciebiada M，Cebula-Obrzut B，et al.Intravenous immunoglobulin replacement therapy in the treatment of patients with common variable immunodeficiency disease:an open-label prospective study［J］.Clin Drug Investig，2011，31(5):299-307.