不同時間電針對急性腦出血大鼠氧化應激反應的影響

張英,黃俊濤,段軼軒,湯園園

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不同時間電針對急性腦出血大鼠氧化應激反應的影響

張英1,黃俊濤2,段軼軒3,湯園園4

(1.江漢大學,武漢 430056;2.宜昌市葛洲壩中心醫院,湖北 443002;3.武漢市武昌區惠民醫院,湖北 430060; 4.湖北中醫藥大學2009級碩士生,武漢 430060)

觀察不同時間點針刺治療對急性腦出血大鼠氧化應激反應的影響。Wistar雄性大鼠隨機分為7組,正常組、模型組(模型1組、模型2組、模型3組、模型4組)、3 h電針組和72 h電針組,采用膠原酶Ⅶ誘發大鼠尾殼核腦出血模型。3 h電針組和72 h電針組分別于造模后3 h、72 h時開始針刺,每日1次,共針刺5次。檢測血紅素氧合酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)和血紅素氧合酶-2(Heme Oxygenase-2,HO-2)。造模后腦組織內見大量腦出血,神經纖維纏結、斷裂;3 h電針組腦組織仍可見泡沫細胞浸潤及出血;72 h電針組腦組織內壞死灶明顯縮小、小膠質細胞浸潤、極少量出血。正常大鼠腦組織均有HO-1和HO-2表達,腦出血大鼠HO-1表達明顯增高,并與時間變化有一定聯系。3 h電針組、72 h電針組HO-1均降低,兩組之間比較差異無統計學意義(＞0.05)。造模后5 d大鼠腦組織內未出現HO-2表達,造模后8 d出現表達,3 h電針組、72 h電針組均出現HO-2表達,72 h電針組較3 h電針組高,差異有統計學意義(＜0.05)。電針可以改善急性腦出血后腦組織出血狀況,降低腦出血后氧化應激反應,對急性腦出血后神經元損傷有一定的修復作用。腦出血后72 h電針比3 h電針療效好,提示急性期腦出血早期應該慎重選擇電針治療。

腦出血;電針;氧化應激;大鼠

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是嚴重危害人類生命和健康的疾病,是中老年人致殘和死亡的主要原因之一。腦出血后損傷組織的氧化應激反應在腦水腫的發生和神經元損傷過程中起重要作用,與患者急性期的存活和后期的康復效果關系密切[1]。針灸治療腦出血的臨床和實驗研究很多[2,3],但是關于針灸治療腦出血的時機仍然存在著較大的爭議。由此我們以膠原酶Ⅶ誘導大鼠尾殼核腦出血為模型,從氧化應激反應角度,研究不同時間點電針對腦組織HO-1和HO-2表達的影響,以期為臨床針刺治療腦出血提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康Wistar雄性大鼠56只,體重在200～250 g,由湖北省疾病預防控制中心提供。

1.1.2 主要實驗用品

主要實驗器械用腦立體定位儀SR-6N型(日本產)、腦立體定位鉆SD-101型(日本產)、G6805-2型針灸治療儀(中國上海)。

主要實驗試劑為膠原酶Ⅶ(1500 U,由南京建成生物試劑有限公司提供);HO-1、HO-2免疫組化染色試劑盒,DAB顯色試劑盒,0.01 mol/L PBS(pH7.2～7.6)(由武漢博士德生物試劑有限公司提供)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組

將大鼠按體重編號,隨機分為7組,正常組、模型組(模型組分為模型1組、模型2組、模型3組、模型4組)、3 h電針組和72 h電針組,每組8只。造模后死亡3只,立即進行補充,所用動物均在江漢大學動物中心飼養。

1.2.2 造模方法

采用膠原酶Ⅶ誘發大鼠尾殼核腦出血模型[4]。動物經10%水合氯醛腹腔麻醉(400 mg/kg)后固定于腦立體定位儀上,以前囟為坐標原點,向后1 mm,矢狀縫向右4 mm,確定注射點坐標,用腦立體定位鉆(直徑1.0 mm)在注射點鉆透顱骨,用1mL的微量注射器吸取0.5mL的膠原酶溶液(1 U/mL)注入,鉆孔處填入醫用無菌棉球止血。腹腔注射氨芐青霉素8萬U,動物清醒后放回籠內飼養。

1.2.3 處理方法

①正常組不進行任何處理。②模型組造模同上。③模型1組和模型2組分別于造模后3 h、72 h時處死,灌注取樣本;分別作為3 h電針組、72 h電針組治療前對照;模型3組和模型4組分別在造模后3 h＋5 d、72 h＋5 d處死,灌注取樣本。分別作為3 h電針組、72 h電針組治療后對照。④電針組造模同上。

針刺用0.30 mm×15 mm毫針針刺水溝、內關(雙側)、三陰交(雙側)。取穴標準及針刺深度參照《常用動物腧穴圖譜》[5]標準而定。接G6805-2型針灸治療儀,選連續波,頻率2 Hz,強度1 mA,留針30 min。

3 h電針組和72 h電針組分別于造模后3 h、72 h時即刻針刺1次,此后4天,每日1次,針刺5次后處死取材。

1.2.4 檢測指標及檢測方法

各組大鼠均用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,開胸經升主動脈依次灌入生理鹽水100 mL、4℃預冷的含4%多聚甲醛的0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH7.4) 400 mL。灌畢取腦,置于4%多聚甲醛溶液過夜后固定。以注射點為中心冠狀石蠟切片,片厚5mm,連續切10片,貼于APES防脫片膠處理的載玻片備染。

1.2.4.1 HE染色

石蠟切片,常規脫蠟水化,蘇木精5 min,水洗,鹽酸乙醇分化20 s,充分水洗,弱氨水返蘭20 s,充分水洗并浸泡10 min,伊紅染色20 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.2.4.2 腦組織HO-1、HO-2測定

采用免疫組化ABC法。

1.2.5 統計學方法

所有實驗數據以均數±標準差表示,運用SPSS14.0 統計軟件進行方差分析,統計學處理采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多個樣本均數之間的兩兩比較采用檢驗。

2 結果

2.1 各組腦組織HE染色比較

正常腦組織未見明顯異常改變;模型1組腦組織內見大量腦出血,神經纖維纏結、斷裂,腦組織內未見明顯小膠質細胞浸潤;模型2組腦組織內見少量出血,少許小膠質細胞浸潤及大量液化性壞死;模型3組腦組織內可見大量小膠質細胞浸潤、壞死伴少量出血;模型4組腦組織內可見液化灶縮小及大量小膠質細胞浸潤; 3 h電針組腦組織內可見泡沫細胞浸潤及出血;72 h電針組腦組織內可見壞死灶明顯縮小、小膠質細胞浸潤、極少量出血。

2.2 各組腦組織HO-1表達的比較

正常組大鼠腦組織有HO-1表達,4個模型組腦組織HO-1表達較正常組均升高(＜0.01),差異有統計學意義,并隨著時間延長而增高,造模5 d后達到高峰,造模后8 d稍有下降;3 h電針組較模型1組HO-1表達增高(＜0.01),較模型3組表達降低(＜0.01); 72 h電針組HO-1表達較模型2組明顯增高,有顯著性差異(＜0.01),較模型4組表達降低,但差異無統計學意義(＞0.05);72 h電針組較3 h電針組稍高,但差異無統計學意義(＞0.05)。詳見表1。

2.3 各組腦組織HO-2表達的比較

正常組大鼠腦組織有HO-2表達,模型1組、模型2組、模型3組均未見HO-2表達,模型4組出現HO-2表達,與正常組相比,差異有統計學意義(＜0.05); 3 h電針組出現HO-2表達,但較正常組表達低,差異有統計學意義(＜0.01);72電針組HO-2表達與正常組相比,差異有統計學意義(＜0.05),與模型4組比,差異有統計學意義(＜0.05),較3 h電針組增高,差異有統計學意義(＜0.05)。詳見表1。

表1 各組腦組織HO-1、HO-2表達的比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.05,2)＜0.01;與模型1組比較3)＜0.01;與模型2組比較4)＜0.01;與模型3組比較5)＜0.01;與模型4組比較6)＜0.05;與3 h電針組比較7)＜0.05

3 討論

3.1 急性腦出血與氧化應激反應

腦出血后由于缺血、缺氧產生大量的氧自由基,破壞機體正常的氧化/還原的動態平衡,造成生物大分子(核酸、蛋白質、脂質)的氧化損傷,形成嚴重的氧化應激狀態,誘導細胞凋亡。HO系統作為含鐵血紅素代謝的限速酶參與了氧化應激反應,HO-1主要在應激狀態下保護細胞和組織,對抗應激反應;HO-2則主要在正常生理狀態下發揮調節作用,對神經元的保護作用更為重要。腦出血大鼠HO-1蛋白表達在出血后12 h到2 d逐漸增強,到2 d時達到高峰,后期的下降則與heme大量降解有關。正常情況下大鼠前腦、中腦、基底節、丘腦區、小腦和腦干等神經元均有強而穩定的HO-2表達。

從本實驗結果來看,HO-1、HO-2均在正常腦組織中出現陽性表達,急性腦出血后大鼠血腫周圍腦組織HO-1表達增高,出血3 h后表達增加,72 h達高峰,持續1星期仍有表達,HO-2在出血后3 h至5 d時均無表達,而在8 d出現表達。說明氧化應激反應可能參與了腦出血后的腦水腫和神經細胞的損害,并與發病時間密切相關,這與其他研究者的研究結果基本一致[6-9]。

3.2 中醫對腦出血的認識

急性“腦出血”與中風一病相近,陽亢風動,氣升血逆為本病的病因病機。本研究參照醒腦開竅法[10]選用內關、水溝、三陰交為主穴,內關、水溝開竅醒神通絡,三陰交生髓醒腦,滋水熄風,補瀉兼施,可收標本兼顧之效。

3.3 不同時間電針對急性腦出血后氧化應激反應的影響

電針對急性腦出血后氧化應激反應具有一定的影響,并因介入的時間不同而出現作用差異。實驗結果提示,3 h電針組療效不及72 h電針組。腦出血后3 h開始電針治療的大鼠,腦組織仍有大量出血和炎癥反應,HO-1的表達較治療前下降,HO-2表達均較治療前增高;腦出血后72 h電針治療的大鼠腦組織壞死病灶較治療前明顯縮小,HO-1表達較治療前降低,HO-2表達較治療前增高,說明電針可能通過降低腦出血后腦組織HO-1表達,提高HO-2表達,通過催化血紅素生成CO、鐵、膽紅素,發揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、調節微循環的作用,從而對腦出血后腦水腫及神經元的修復產生一定的影響,但不同時機進行針刺治療存在療效差異,提示臨床治療腦出血應注意針刺時機的選擇。

所以出現以上結果,可能與以下因素有關。①急性腦出血極早期采用電針治療,可能形成了較強的刺激,有加重腦出血可能;②腦出血后1星期內,氧化應激反應處于上升階段,可能影響電針治療效果評價;③動物的自我修復能力較強。在實驗中我們發現,未接受針刺治療,即造模后自然存活至實驗結束大鼠與72 h電針組大鼠相比,腦組織出血、HO-1表達無明顯差異,HO-2表達尚高于72 h電針組,可能與大鼠急性腦出血后的自我修復有關。

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Effects of Electroacupuncture at Different Times on Oxidative Stress Reaction in Rats with Acute Cerebral Hemorrhage

1,-2,-3,-4.

1.,430056,; 2.,,443002,; 3.,430060,; 4.’2009,,430060,

To investigate the effects of electroacupuncture at different time points on oxidative stress reaction in rats with acute cerebral hemorrhage.Wistar rats were randomly allocated to seven groups: normal, model (1, 2, 3 and 4), 3 h electroacupuncture and 72 h electroacupuncture. A rat model of caudate and putaminal hemorrhage was made using collagenase Ⅶ. The 3 h and 72 h electroacupuncture groups were acupunctured at 3 hrs and 72 hrs after model making, respectively. Acupuncture was given once daily, for 5 times. Heme oxygenase-1 (OH-1) and heme oxygenase-2 (OH-2) were measured.Cerebral hemorrhage, and neurofibrillary tangles and disruption appeared after model making. Cerebral foam cell infiltration and bleeding was still visible in the 3 h electroacupuncture group. The necrotic foci became small obviously and microglia infiltration and very small amounts of blooding existed in the brain tissue in the 72 h electroacupuncture group. Cerebral OH-1 and OH-2 were both expressed in the normal rats. The OH-1 expression increased significantly and was related to the time change in the cerebral hemorrhage rats. The OH-1 expression decreased in both 3 h and 72 h electroacupuncture groups, but there was no statistically significant difference between the two groups (＞0.05). Rat cerebral OH-2 expression did not appear at 5 days after model making but did at 8 days. The OH-2 expression appeared in both 3 h and 72 h electroacupuncture groups and was higher in the 72 h electroacupuncture group than in the 3 h electroacupuncture group. The difference was statistically significant (＜0.05).Electroacupuncture can reduce brain tissue bleeding and oxidative stress reaction and has a certain repairing effect on injured neurons after acute cerebral hemorrhage. The therapeutic effect of electroacupuncture at 72 hrs after cerebral hemorrhage is better than that at 3 hrs, suggesting that electroacupuncture treatment should be cautiously selected in the early stage of acute cerebral hemorrhage.

Cerebral hemorrhage; Electroacupuncture; Oxidative stress reaction; Rat

1005-0957(2011)06-0418-03

R2-03

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.06.418

2010-12-20

張英(1968 - ),女,副教授,博士

A