鮭魚降鈣素對乳腺癌骨轉移大鼠機械痛敏的影響

王明霞，孫長崗，唐世鋒

(1.濰坊醫學院，山東濰坊261042;2.濰坊市中醫院腫瘤科，山東濰坊261041)

乳腺癌是成年女性多發的惡性腫瘤，有很高的發病率和死亡率，骨骼是乳腺癌轉移最常見的部位，且癌性骨轉移對患者的生活質量和身體機能影響較大［1］。因此針對癌性骨痛治療的研究受到廣泛關注。蛙魚降鈣素的主要作用是抑制破骨細胞的活性，防止骨鈣丟失，減少骨吸收而增加骨質量，其生物活性比人類降鈣素高20～40倍，其也具有一定的抗炎和中樞止痛作用。本實驗主要研究其對癌性骨轉移所致疼痛的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 雌性Wistar大鼠60只，體質量180～200 g，購自山東大學實驗動物中心;鮭魚降鈣素，購自慶安醫藥公司;von－Frey全套毛針BME－403，由中國醫學科學院生物工程研究所提供;Walker 256細胞，購自北京百和科技發展有限責任公司;唑來膦酸，購自美國LKT公司。

1.2 乳腺癌骨轉移模型的制備

1.2.1 細胞體外無菌環境培養方法 取出Walker 256細胞凍存管，迅速放入37℃水浴箱中快速解凍。擦干凍存管上的水漬，用體積分數75%酒精消毒管口，超凈工作臺上旋開管口，用吸管吸出細胞懸液，移入離心管中，再補加適量含質量分數10%胎牛血清的RPMI－1640培養基，吹打使細胞懸浮，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復用培養基漂洗1次，加入適量培養基后接種于培養瓶中，置于培養箱中培養，次日更換1次培養基繼續培養，觀察生長情況，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞 Wistar大鼠體內環境培養方法 選擇Wistar大鼠乳腺癌肉瘤細胞株Walker 256細胞，于同系Wistar大鼠腹腔內接種Walker 256細胞0.5 mL(2×107mL－1)，飼養1周，大鼠腹腔內有大量腹水，取微黃色瘤性腹水3 mL，加質量分數0.9%生理鹽水7 mL混勻，1 500 r/min離心5 min，取沉淀，用質量分數0.9%生理鹽水10 mL漂洗后，1 200 r/min再次離心5 min，棄上清，細胞沉淀用3 mL質量分數0.9%生理鹽水懸浮，細胞計數后將細胞懸液稀釋到2×107mL－1備用。

1.2.3 大鼠乳腺癌骨轉移癌痛模型建立 參照姚明等［2］的方法建立大鼠脛骨癌痛模型:質量分數4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉后，以大鼠腳趾對有齒鑷鉗夾無反應為麻醉滿意指標，消毒并切開左側脛骨下1/3皮膚，分離肌肉，暴露脛骨骨面。取5號鋼針頭垂直于骨面進針，待有骨突破感后拔出針頭，用注射器取細胞懸液5 μL注入骨髓腔內，用無菌骨蠟封孔，逐層用質量分數0.9%生理鹽水沖洗并縫合。接種腫瘤細胞手術后將動物放置于籠中繼續飼養。假手術動物(即空白組)注入等量的質量分數0.9%生理鹽水。

1.3 實驗分組及給藥 接種腫瘤細胞手術后第8天始給藥。鮭魚降鈣素組:骨癌痛模型制備成功后，隔日皮下注射鮭魚降鈣素7.5 ng/d;鮭魚降鈣素+唑來膦酸組:骨癌痛模型制備成功后，隔日皮下注射鮭魚降鈣素 7.5 ng/d+ 緩慢皮下注射唑來膦酸 0.1 mg/kg，2次/周;唑來膦酸組:骨癌痛模型制備成功后，隔日緩慢皮下注射唑來膦酸0.1 mg/kg，2次/周，其余時間給予質量分數0.9%生理鹽水;對照組:骨癌痛模型制備成功后，隔日皮下注射質量分數0.9%生理鹽水;空白組:隔日皮下注射質量分數0.9%生理鹽水。

1.4 機械痛敏的測定 接種腫瘤細胞手術后的第8、13、18、23、28 天，用電子 von Frey測痛儀刺激大鼠足底柔軟部位，接觸時間2～3 s，出現縮足或舔足反應時的讀數為機械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，閾值上下各刺激3次，間隔5 min。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計分析，計量資料以±s表示，比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結果

與空白組相比，大鼠于骨癌痛模型制備后的第8天MWT明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)。與對照組相比，各治療組大鼠于骨癌痛模型制備后的第18、23天MWT提高，其中鮭魚降鈣素+唑來膦酸組MWT升高明顯，差異有統計學意義(P＜0.05);鮭魚降鈣素組、唑來膦酸組僅表現出MWT升高趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)。于骨癌痛模型制備后的第28天，各治療組MWT較對照組提高，差異有統計學意義(P＜0.05)。提示鮭魚降鈣素、唑來膦酸對癌性骨痛大鼠均具有提高MWT，降低機械痛敏的作用。見表1。

表1 術后不同時點大鼠MWT的比較

3 討論

腫瘤轉移至骨骼系統將誘發產生持續性骨癌痛，且隨著時間推移日益加劇，可造成患者的身體機能和生活質量嚴重下降。有研究表明，高達80%的乳腺癌患者會在不同階段出現骨轉移病灶，而由乳腺癌骨轉移所引起的骨相關事件(高鈣血癥、病理性骨折、骨痛、神經壓迫癥狀等)是導致晚期患者生活質量嚴重下降及致死的重要原因之一［3－5］。目前乳腺癌骨轉移的治療方法主要有放療、化療、內分泌治療和靶向治療，但這些方案都有一定的局限性。因此，發現新的藥物治療骨癌痛至關重要。而1999年Schwei等［6］首次報道了小鼠骨癌痛的模型，推動了癌痛的基礎研究，為抗癌痛藥物的研制及發現提供了一個很好的平臺。

本實驗在骨癌痛模型制備成功后，分別給予鮭魚降鈣素、唑來膦酸或兩藥聯合，通過測定MWT觀察鮭魚降鈣素用于乳腺癌骨轉移性癌痛的可行性及效果，結果表明鮭魚降鈣素和唑來膦酸聯合應用效果最佳。

綜上所述，鮭魚降鈣素能減輕骨癌痛，鮭魚降鈣素和唑來膦酸聯合使用效果更加明顯。這為臨床用藥提供了理論依據，也為骨癌痛的治療提供了新思路。

［1］Ghilardi JR，R?hrich H，Lindsay TH，et al.Selective blockade of the capsaicin receptor TRPV1 attenuates bone cancer pain［J］.J Neurosci，2005，25(12):3126 －3131.

［2］姚明，楊建平，王麗娜，等.腹水傳代與體外培養Walker 256癌細胞系建立大鼠骨癌痛模型的可行性［J］.中華醫學雜志，2008，88(13):880－884.

［3］Martin TJ，Moseley JM.Mechanisms in the skeletal complications of breast cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2000，7(4):271 －284.

［4］Weiss L.Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy［J］.Clin Exp Metastasis，1992，10(3):191－199.

［5］Yoneda T，Williams PJ，Hiraga T，et al.A bone－seeking clone exhibits different biological properties from the MDA－MB－231 parental human breast cancer cells and a brain－seeking clone in vivo and in vitro［J］.J Bone Miner Res，2001，16(8):1486 －1495.

［6］Schwei MJ，Honore P，Rogers SD，et al.Neurochemical and cellular reorganization of the spinal cord in a murine model of bone cancer pain［J］.J Neurosci，1999，19(24):10886 －10897.