益心解毒顆粒質量標準研究

林玉紅 楊娟英 謝 偉 王月茹 陜西步長制藥有限公司(西安 710075)

益心解毒顆粒由黃芪、麥冬、地黃、金銀花、黃連、五味子、防風、酸棗仁和丹參等中藥材組成,具有益氣養陰,清熱解毒之功效。用于病毒性心肌炎氣陰兩虛、熱侵心包證型。證見心悸,氣短,胸悶不適,乏力,低熱,咽干咽痛,五心煩熱,心煩,多汗,失眠,舌淡紅或舌紅,苔薄黃或薄白,脈沉細或結代者。為能有效控制益心解毒顆粒的質量,本實驗采用薄層色譜法及高效液相色譜法對其進行了質量標準的研究。

1 儀器與試藥 1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀,Alltech500型 ELSD檢測器,M illennium 32色譜工作站。

1.2 試藥 黃芪甲苷對照品、鹽酸小檗堿對照品、金銀花對照藥材、綠原酸對照品、麥冬對照藥材、原兒茶醛對照品、五味子乙素對照品(中國藥品生物制品檢定所提供),甲醇、乙腈均為色譜純,其他試劑均為分析純。益心解毒顆粒由山東步長制藥有限公司生產提供。

2 方法與結果 2.1 薄層層析定性鑒別 2.1.1 麥冬的薄層鑒別:取本品 6g,加水 30m L,加熱使溶解,加入 1.5m L鹽酸,加熱煮沸 10min,放冷,加水補足至 30m L,加氯仿提取 3次,每次 30m L,合并提取液,濃縮至約 2m L,作為供試品溶液;另取麥冬對照藥材 2g,加水30m L,煎煮 20min,濾過,濾液加鹽酸0.5m L,同法制成對照藥材溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗,吸取供試品溶液 4μL,對照藥材溶液8μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,以氯仿-丙酮 (7:1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以 10%硫酸乙醇溶液,在105℃加熱至斑點顯色清晰,供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的主斑點,而陰性無干擾。

2.1.2 金銀花的薄層鑒別:取本品 4g,加水30m L,加熱使溶解,放冷 ,加鹽酸調 p H值=1～ 2,用醋酸乙酯提取 3次,每次 15m L,合并醋酸乙酯提取液,蒸干,殘渣加甲醇 5m L使溶解,作為供試品溶液;另取金銀花對照藥材 0.5g,加甲醇 15m L,超聲處理 20min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇5m L使溶解,作為對照藥材溶液;再取綠原酸對照品,加甲醇制成每 1m L含 1mg的溶液,作為對照品溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗,吸取供試品溶液5μL,對照藥材溶液 3μL,對照品溶液 2μL,分別點于同一聚酰胺薄膜上,以 25%冰醋酸溶液為展開劑 (展距 6cm),展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視,供試品色譜中,分別在與對照品色譜及對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,而陰性無干擾。

2.1.3 黃連的薄層鑒別:取本品 1g,加乙醇20m L,超聲處理 20min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇5m l使溶解,作為供試品溶液;另取黃連對照藥材 0.5g,同法制成對照藥材溶液;再取鹽酸小檗堿對照品,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作為對照品溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗,吸取上述三種溶液各 5μL,分別點于同一硅膠 G薄層板上,以正丁醇-冰醋酸-水(7∶ 1∶2)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365nm)下檢視,供試品色譜中,在與對照藥材及對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,而陰性無干擾。

2.1.4 五味子的薄層鑒別:取本品 10g,加水40m L,加熱使溶解,放冷,用水飽和的乙醚提取 2次,每次 20m L,合并提取液,揮去乙醚,殘渣加醋酸乙酯2m L使溶解,作為供試品溶液;另取五味子乙素對照品,加醋酸乙酯制成每 1m L含 1m g的溶液,作為對照品溶液;照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗,吸取供試品溶液 10μL,對照品溶液 4μL,分別點于同一硅膠GF254薄層板上,以甲苯-醋酸乙酯(9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,而陰性無干擾。

2.1.5 丹參的薄層鑒別:取本品8g,加鹽酸溶液(5→100)40m L,水浴加熱 1h,用水飽和的乙醚提取 2次,每次 40m L,合并乙醚液,回收乙醚至約 15m L,用2%碳酸鈉水溶液洗滌 2次,每次 10m L,合并堿液,加鹽酸調 PH值至 2,用水飽和的乙醚提取 3次,每次15m L,合并提取液,揮干,殘渣加甲醇 2m L使溶解,作為供試品溶液;另取原兒茶醛對照品,加甲醇制成每1m L含 0.5mg的溶液,作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典 2010年版一部附錄ⅥB)試驗,吸取供試品溶液 10μL,對照品溶液 2μL,分別點于同一硅膠 G薄層板上,以甲苯-醋酸乙酯-甲酸 (15∶ 10∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以新鮮配制的 1%間苯三酚乙醇-濃硫酸 (1∶ 1)的混合溶液,供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,而陰性無干擾。

2.2 黃芪甲苷含量測定 2.2.1 色譜條件:色譜柱:Kromosil ODSC18(5μm,4.6mm×250mm);流動相:乙腈 -水 (32∶ 68);柱溫:40℃;流速 ,1.2m L/min;漂移管溫度:105℃;載氣流量:2.5L? min-1;放大系數:1[1]。

2.2.2 對照品溶液的制備:取黃芪甲苷對照品適量,加甲醇制成每 1m L含 0.5mg的溶液,作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備:精確稱取益心解毒顆粒約 10g,置于錐形瓶中,加入甲醇 50m L,超聲處理30min,濾過,棄去初濾液,精密移取續濾液 25m L,水浴蒸干,殘渣加水20m L溶解,并用石油醚萃取 4次,每次10m L,棄去石油醚層,水層揮發至無醚味;繼續用飽和正丁醇萃取 3次,每次 10m L,合并正丁醇提取液,用1%的氫氧化鈉溶液洗滌3次,每次15m L,棄去氫氧化鈉溶液,將正丁醇溶液蒸干,殘渣加入 4m L甲醇溶解,并用 0.45μm微孔濾膜濾過,即得。

2.2.4 空白試驗:陰性對照的制備:以處方中藥味比例和制備工藝制成不含白芍的空白樣品,再按供試品制備方法處理,制成陰性對照溶液。吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液 10μL注入液相色譜儀,依法測定。結果對照品溶液與供試品溶液在相同的保留時間有相應的峰,而陰性對照沒有。說明測定的專屬性好、無干擾。

2.2.5 標準曲線的繪制:分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液 (濃度 0.48mg/m l)2、 4、6、8、10μL,按上述色譜條件注入色譜儀,以峰面積為縱坐標,黃芪甲苷進樣量(μg)為橫坐標繪制標準曲線,回歸方程為 Y=1215244X+25631.3,相關系數 r=0.9998,黃芪甲苷在 0.96μg～ 4.8μg之間有良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗:取黃芪甲苷對照品溶液,重復進樣6次,記錄峰面積,結果 RSD為0.3%,表明本方法精密度良好。

2.2.7 重復性試驗:取本品適量,共 6份,照“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液,分別精密取 10μL進樣,在上述色譜條件下測得樣品,RSD為 1.36%,結果表明此方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗:采取加樣回收法,取一定量已知含量的樣品 6份,分別加入黃芪甲苷對照品適量,照“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液,在上述色譜條件下測定含量,計算回收率(見表1)。

表1 回收率實驗結果

2.2.9 穩定性試驗:精密取本品適量,照“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液 ,分別于 0、 2、 4、 8、 12、24h進樣,記錄峰面積,結果 RSD為 1.38%,表明供試品在24h內穩定性良好。

2.2.10 樣品的含量測定:取本品 3批樣(10g/袋),照“2.2.3”項下的方法制備供試品溶液,依上述色譜條件測定,其中含黃芪甲苷的最高為 1.38mg/袋,最低為 1.21 mg/袋,考慮到藥材的來源,參考其他黃芪制劑含量限量,暫定本品每袋含黃芪以黃芪甲苷計,不得少于1.20mg,并規定本品所用黃芪藥材含黃芪甲苷按《中國藥典》2010年版一部黃芪項下有關規定執行。

3 小結與討論 在薄層鑒別研究中[1],我們曾對處方中地黃、防風和酸棗仁進行鑒別,根據藥典和文獻報道的方法進行了供試品溶液的制備,由于處方中所含化學成分種類多,性質相似,通過采用多種方法進行了探討,但均未獲得滿意的結果,無法得到穩定的薄層鑒別方法,故均未收入標準正文。

目前,有關黃芪甲苷含量測定的方法已有不少報道[2,3,4],多采用薄層掃描法、比色法等。益心解毒顆粒中除君藥黃芪外,還有炙甘草等藥材均含有較多皂苷類成分,會嚴重干擾黃芪甲苷的測定。為此,我們在實驗中采用多種供試品制備方法以及多種色譜條件的嘗試,最終確定了本實驗中所述的最佳條件。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 [M].北京:化學工業出版社,2010.

[2] 王 寶 ,蘇 健,魯 靜.黃芪甲大甙的檢測在中藥質控中的應用[J].中國中藥雜志,1996,21(3):161-164.

[3] 龍恩武,張一萍.黃芪及其制劑中黃芪甲苷測定方法研究進展 [J].時珍國醫國藥 ,2000,11(9):854-855.

[4] 李 江 ,李穎倩.黃芪甲甙分析方法研究概況 [J].北京中醫,2000,19(4):50-51.