高效液相色譜-質譜串聯法測定人血漿特拉唑嗪的濃度

侯允天，郝光濤，鄭專杰，梁海霞，馬蒙，朱力軍，劉澤源

(1.解放軍總醫院老年心血管病研究所，北京 100853;2.軍事醫學科學院附屬醫院臨床藥理室，北京 100071;3.首都醫科大學附屬北京安定醫院藥劑科，100088;4.蚌埠醫學院藥學系，安徽蚌埠 233030)

鹽酸特拉唑嗪(Terazosin)是一種新型高效的選擇性α1受體阻斷藥，對動脈和靜脈的α1受體有較高的選擇性阻斷作用，對去甲腎上腺能神經末梢突觸前膜α2無明顯作用，因此在拮抗去甲腎上腺素和腎上腺素的升壓作用時，無促進神經末梢釋放去甲腎上腺素及明顯加快心率的作用，它是哌唑嗪的類似物，與哌唑嗪比較，特拉唑嗪的降壓作用出現較慢，且呈良好的線性量效關系而持續時間不變。但作用時間較長，半衰期(t1/2)較哌唑嗪長2～3倍，每天一次給藥即能有效控制24 h血壓［1-6］，是目前老年高血壓并發前列腺肥大患者臨床應用的一種較好的降血壓藥。人體前列腺組織中的受體主要以α1腎上腺素能受體為主，而前列腺平滑肌的收縮主要受α1腎上腺素能受體的調控。因此，特拉唑嗪作為α1受體阻斷藥能減少前列腺尿道阻力，緩解排尿困難［7-10］，是一種治療良性前列腺增生較好的藥物。筆者在本研究建立高效液相色譜-質譜串聯(HPLC-MS/MS)法測定人體血漿中特拉唑嗪濃度，為特拉唑嗪藥動學探討提供方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津(SHIMADZU)高效液相色譜-質譜串聯聯用儀，其中島津(SHIMADZU)高效液相色譜系統包括二元輸液泵、自動進樣器、柱溫箱;串聯質譜儀為API 3200型三重四極桿串聯質譜儀，含電噴霧離子化源以及串聯三重四極桿質譜檢測器。色譜工作站:Analyst 1.4.2數據處理軟件(美國 AB公司)。GL-88B旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);AB104電子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO公司);B600A型低速自動平衡離心機(中國白洋離心機廠);Milli-Q Plus純水器(美國密理博中國有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸特拉唑嗪對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，含量 99.3%，批號:100375-200502)，鹽酸哌唑嗪對照品(內標，中國藥品生物制品檢定所提供，批號:100164-200402)，甲醇、乙腈均為色譜純(DIMA公司)，試驗用水為去離子水(本實驗室自制)，其他試劑為AR試劑。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Inertsil-C18柱(2.1mm×150mm，3.0 μm);預柱:Shim-pack GVP-ODS(5mm ×2.0mm);流動相:甲醇-水(2mmol·L-1醋酸銨)=90∶10;流速:0.2mL·min-1;柱溫:20℃;進樣量:5 μL。

2.2 質譜條件 離子源為ESI源;正離子方式檢測;多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)方式;噴射電壓:5 500 V;離子源溫度:450℃;源內氣體1［氮氣(N2)］壓強:306 kPa;源內氣體2(N2)壓強:374 kPa;氣簾氣體(N2)壓強:68 kPa;碰撞能量:45 V;DP電壓:65 V;碰撞氣(N2)壓力:40.8 kPa;用于定量分析的離子反應對分別為質荷比(m/z)388.4μm/z 247.4(特拉唑嗪)和 m/z384.2 μm/z 231.3(哌唑嗪，內標)。

2.3 溶液的配制

2.3.1 鹽酸特拉唑嗪標準溶液的配制 精密稱取鹽酸特拉唑嗪對照品11.9 mg，相當于特拉唑嗪10 mg，置于50mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200.0 μg·mL-1特拉唑嗪的標準儲備液，取該儲備液1.25mL置于50mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得5 000 ng·mL-1特拉唑嗪甲醇溶液;再以甲醇依次倍比稀釋，配成濃度分別為250，100，25，10，5，2 和 1 ng·mL-1的特拉唑嗪標準溶液。

2.3.2 內標(哌唑嗪)標準溶液的配制 精密稱取鹽酸哌唑嗪對照品11.0 mg，置于10mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100.0 μg·mL-1的內標儲備液，取該儲備液加入甲醇倍比稀釋至100.0 ng·mL-1，作為內標工作溶液待用。對照品溶液于4℃冰箱保存待用。

2.4 樣品預處理 精密量取血漿樣品200 μL，置10mL磨口玻璃試管中，分別加入100 ng·mL-1哌唑嗪甲醇溶液(內標溶液)40 μL、甲醇 40 μL、飽和碳酸鈉溶液100 μL，漩渦混合30 s，再加入叔丁基甲醚2mL，充分渦旋震蕩2 min，2 500 r·min-1離心5 min，取上清液叔丁基甲醚置于旋口玻璃試管中40℃水浴氮氣揮干，殘渣用200 μL流動相復溶，進樣5 μL進行HPLCMS/MS分析。

2.5 分析方法確證

2.5.1 質譜分析 取特拉唑嗪和哌唑嗪標準儲備液適量用甲醇稀釋成濃度為1.0 μg·mL-1的甲醇溶液，按“2.2”項操作，相應的二級全掃描質譜圖見圖1。

2.5.2 相對基質效應考察 分別取6個不同受試者的空白血漿200 μL，置于10mL磨口玻璃試管中，按“2.4”項下操作，進樣量為5 μL，每個受試者空白血漿各做3份;并同時做一條隨行的標準曲線，根據標準曲線計算血漿樣品實測濃度。結果顯示所有試驗測定值與標示量的相對標準偏差(RSD)均在±20% 之間，精密度為9.07%(＜15%)，則可認為沒有基質效應干擾［11］。

圖1 特拉唑嗪和內標哌唑嗪的產物離子掃描質譜圖A.特拉唑嗪;B.哌唑嗪(內標)Fig.1 Full-scan production spectra of terazosin and internal standardA.terazosin;B.prazosin(internal standard)

2.5.3 方法專屬性 分別取6名受試者的空白血漿200 μL，除不加內標溶液并另外補加甲醇40 μL外，其余按“2.4”項下方法操作，進樣5 μL，獲得空白樣品的色譜圖(圖2A);將一定濃度的特拉唑嗪標準溶液和內標哌唑嗪溶液加入空白血漿中，依同法進行樣品處理，獲得相應的色譜圖:最低定量限(圖2B)，標準曲線中間濃度(圖2C);取受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法進行樣品處理，獲得相應的色譜圖(圖2D)。結果表明，空白血漿中的內源性物質不干擾特拉唑嗪和哌唑嗪的測定。

圖2 血漿中特拉唑嗪(Ⅰ)和內標哌唑嗪(Ⅱ)的典型MRM色譜圖A.空白血漿;B.空白血漿中加入0.2 ng·mL-1特拉唑嗪和100 ng·mL-1哌唑嗪;C.空白血漿中加入2 ng·mL-1特拉唑嗪和100 ng·mL-1哌唑嗪;D.1號受試者第Ⅰ周期第3個點的血漿樣品Fig.2 Typical MRM chromatograms of terazosin(Ⅰ)and prazosin(Ⅱ)in plasma samplesA.Blank plasma;B.Blank plasma spiked with 0.2 ng·mL-1 terazosin and 100 ng·mL-1prazosin;C.Blank plasma spiked with 2 ng·mL-1terazosin and 100 ng·mL-1prazosin;D.Plasma sample from No.1 volunteer at the 3rd time point in the 1st periodicity

2.5.4 線性關系考察 取空白血漿200 μL，分別精密加入標準系列溶液的特拉唑嗪對照品溶液和內標溶液各40 μL，渦旋混勻，配成特拉唑嗪濃度分別為0.2，0.5，1，2，5，20 和 50 ng·mL-1的標準含藥血漿，按“2.4”項下操作，記錄色譜圖，以血漿中待測物濃度(X)為橫坐標，待測物與內標的峰面積比值(Y)為縱坐標，用加權(w=1/x2)最小二乘法進行回歸運算［12］，得回歸方程:Y=0.006X+0.025 4，r=0.997 3，特拉唑嗪的線性范圍是0.2 ～50.0 ng·mL-1，定量下限為0.2 ng·mL-1。

2.5.5 精密度和準確度 按“2.5.3”項分別制備特拉唑嗪低、中、高 3個濃度血漿樣品 0.5，2，20 ng·mL-1的質量控制樣品，每個濃度6份樣品，連續測定3 d，得血漿中特拉唑嗪血漿中低、中、高濃度的平均日內RSD 分別為8.64%，3.77%和 10.55%，日間 RSD 分別為8.15%，9.37%和 9.30%，均＜15%，平均相對回收率分別為(100.67±9.03)%，(98.83±4.37)% 和(99.25±11.03)%，低、中、高絕對回收率在分別為75.40%，70.28%，67.39%。

2.5.6 樣品穩定性考察 制備血漿樣品的低、中、高(0.5，2，20 ng·mL-1)三個濃度的質控樣品，分別進行了進樣器放置6 h、室溫放置4 h、反復凍融3次(－20℃)和長期穩定性(－20℃冰凍放置30 d)4種穩定性的考察，結果顯示所有穩定性實驗中實測值與添加值的RSD均＜15%，表明特拉唑嗪血漿樣品在進樣器中放置6 h、室溫放置4 h、反復凍融3次(－20℃)及－20℃凍存1個月條件下穩定性良好。

3 討論

筆者在本試驗采用HPLC-MS/MS法測定特拉唑嗪血藥濃度，具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單等優點。特拉唑嗪在人體血漿中濃度較低，本法測定的定量下限較其他方法低(0.2 ng·mL-1)［13-14］可以更準確測定血漿中的濃度，且方法簡便可靠。

特拉唑嗪為生物堿，常制成鹽酸鹽，故需加入碳酸鈉進行中和以使特拉唑嗪游離在有機相叔丁基甲醚中，從而進行液相提取。在氮氣流下吹干濃縮可以大大提高分析方法的靈敏度，使樣品富集更徹底，不但簡化樣品處理方法，更減輕受試者的負擔，成本較低，更適合于本研究，可見此方法是一種優先的前處理方案。

本試驗建立的血漿特拉唑嗪的 HPLC-MS/MS測定法簡單，靈敏，適合特拉唑嗪藥動學的研究。

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