HPLC 法測定蝙蝠葛堿與大鼠和人血漿蛋白的結合率

高秀蓉，蔣學華，王婷（.四川大學華西藥學院臨床藥學與藥事管理學系，成都市6004；2.成都醫學院藥學院藥劑教研室，成都市 60083）

北豆根為防己科蝙蝠葛屬多年生藤本植物蝙蝠葛Menispermum dauricumDC的干燥根莖，1977年版《中國藥典》始見北豆根，具有抗炎、抗菌、抗癌、清熱解毒、消腫利咽和止痛的功效，以及心血管系統作用，目前臨床用于治療扁桃體炎、咽喉腫痛、牙齦腫痛等[1]。北豆根主要成分為生物堿，現已知北豆根中含有近20種生物堿，總堿含量為1%以上，其中含量最高的為蝙蝠葛堿（Dauricine）[2，3]。蝙蝠葛堿是一種廣譜的抗心律失常藥，適用于快速型心律失常，尤其對房性、交界性和室性早搏效果較佳；對預激綜合征伴室性心動過速效果也好[4，5]。

血漿蛋白結合率是藥物重要的藥動學參數，藥物與血漿蛋白結合后將不能被機體處置（如分布、代謝和排泄），僅游離藥物能發生這些藥動學過程和發揮藥理作用，所以血漿蛋白結合率的高低將直接影響藥物在血中游離藥物的濃度，從而影響藥物藥理作用的發揮和毒性作用[6]。蝙蝠葛堿屬于雙芐基異喹啉類生物堿，屬于毒性藥物，治療窗較窄，本課題組對蝙蝠葛堿在大鼠體內藥動學過程進行了研究，發現其口服生物利用度低（約15%），生物半衰期較長（大鼠血漿中約5～7 h），對其血漿蛋白結合率進行測定將有助于解釋這些體內藥動學參數和體內過程。而目前尚未見文獻對蝙蝠葛堿血漿蛋白結合率進行測定，故筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對蝙蝠葛堿的人和大鼠血漿蛋白結合率進行了測定，以期為臨床合理設計蝙蝠葛堿給藥方案提供依據，也為蝙蝠葛堿制劑的研發提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2010C HT型高效液相色譜儀（日本Shimdazu公司）；BP210S型、CP235D型電子天平（德國Sartorius公司）；Votex Genius 3型旋渦混合儀（德國IKA公司）；HGC-36AC型氮吹儀（上海泉島科貿有限公司）；CQ-205型超聲清洗儀（上海超聲波儀器廠）；TDL-5型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；超純水機（成都品成科技有限公司）；透析袋（上海歐韋達儀器科技有限公司，截留分子量8 000～15 000 Da）。

1.2 試藥

蝙蝠葛堿原料藥（純度：＞98.0%）、蝙蝠葛堿標準品（純度：＞99.0%）均由深圳市維琪生物科技有限公司提供；粉防己堿（內標，中國藥品生物制品檢定所，純度：＞99.5%）；HPLC所用試劑為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

SD大鼠10只，♂，體重220～250 g，由四川大學實驗動物中心提供（動物生產許可證號：SCXK（川）2005-02）；大鼠腹主動脈取血，肝素抗凝，離心，分離血漿，－20℃貯藏，備用。人血漿由成都市血液中心提供。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 空白透析液的制備 稱取磷酸二氫鈉1.563 g，氯化鈉4.437 g，加超純水溶解，用1 mol·L-1的氫氧化鈉調節pH值至7.4，定溶至500 mL，0.45 μm的微孔濾膜過濾后，即得0.02 mol·L-1、pH7.4的磷酸二氫鈉緩沖液（含0.15 mol·L-1氯化鈉）。

2.1.2 標準曲線工作溶液的制備 稱取干燥至恒重的蝙蝠葛堿標準品，用甲醇溶解制備成濃度為302.00μg·mL-1的蝙蝠葛堿貯備液，吸取該貯備液2 mL，甲醇定容于10 mL容量瓶中，得濃度為60.40μg·mL-1的工作溶液①，精密吸取工作溶液①5 mL，置10 mL量瓶中，以甲醇定容，得濃度為30.20μg·mL-1的工作液②；依次往下稀釋，分別得濃度為15.10、7.55、3.78、1.89和0.94 μg·mL-1的系列工作液，4 ℃貯藏，備用。

2.1.3 內標液的制備 稱取粉防己堿1.44 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，得28.8 μg·mL-1的內標貯備液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Sepax C18（250 mm×5.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（78∶22，含1%三乙胺和0.21%磷酸）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：284 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.3 樣品處理

2.3.1 透析內液樣品的處理 精密吸取透析袋內液100 μL，加入25 μL內標液，渦旋混勻后加入500 μL乙酸乙酯、100 μL 2 mol·L-1的氫氧化鈉溶液堿化，強力混旋5 min，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液用N2吹干，用100 μL流動相復溶，混旋，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液于“2.2”項下色譜條件測定。

2.3.2 透析外液樣品的處理 取透析袋外液100 μL，13 000 r·min-1離心5 min，取上清液于“2.2”項下色譜條件測定。

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法專屬性考察 分別取空白血漿、空白透析液及含蝙蝠葛堿的血漿樣品或透析液樣品，按照“2.3”項下方法處理樣品，在“2.2”項下色譜條件測定，可見空白血漿、空白透析液在此條件下對蝙蝠葛堿的測定無干擾。蝙蝠葛堿HPLC見圖1。

2.4.2 標準曲線的制備 （1）透析外液：取標準曲線工作溶液各25μL，加入75μL空白透析液，渦旋混勻，得蝙蝠葛堿溶液濃度分別為15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 μg·mL-1的透析外液標準溶液。按“2.3”項下方法進行樣品處理和“2.2”項下色譜條件測定。以蝙蝠葛堿的峰面積積分值（Y）為縱坐標，蝙蝠葛堿濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得蝙蝠葛堿回歸方程為Y＝34 026.70X+2 801.21（r＝0.999 6）。結果表明，透析外液中的蝙蝠葛堿檢測濃度在0.24～15.10 μg·mL-1范圍內與其峰面積積分值線性關系良好。（2）透析內液（大鼠血漿）：取標準曲線工作溶液各25μL，分別加入75μL空白大鼠血漿，渦旋混勻，得蝙蝠葛堿溶液濃度分別為15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 μg·mL-1的含藥血漿，然后分別加入25 μL內標液。按“2.3”項下方法處理樣品和“2.2”項下色譜條件進行測定。以蝙蝠葛堿標準品和粉防己堿內標液的峰面積之比（Y）為縱坐標，血漿中的蝙蝠葛堿濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.155 8X+0.005 7（r＝0.998 8）。結果表明，大鼠血漿中蝙蝠葛堿檢測濃度在0.24～15.10 μg·mL-1范圍內與蝙蝠葛堿標準品和粉防己堿內標液的峰面積之比線性關系良好。（3）透析內液（人血漿）：取標準曲線工作溶液各25μL，加入75μL空白人血漿，渦旋混勻，得蝙蝠葛堿濃度分別為15.10、7.55、3.78、1.89、0.94、0.47、0.24 μg·mL-1的含藥血漿，然后分別加入25μL內標液。按“2.3”項下方法處理樣品和“2.2”項下色譜條件測定。以蝙蝠葛堿標準品和粉防己堿內標液的峰面積之比（Y）為縱坐標，血漿中的蝙蝠葛堿濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝0.172 3X+0.004 0（r＝0.998 9）。結果表明，人血漿中蝙蝠葛堿檢測濃度在0.24～15.1 μg·mL-1范圍內與蝙蝠葛堿標準品和粉防己堿內標液的峰面積之比線性關系良好。

圖1 蝙蝠葛堿的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms of dauricine

2.4.3 血漿樣品提取回收率考察 精密吸取大鼠血漿（或人血漿）75 μL，加入25 μL標準曲線工作溶液，配制蝙蝠葛堿高、中、低濃度（7.55、1.89、0.47 μg·mL-1）樣品，以提取后的蝙蝠葛堿峰面積與未經提取直接進樣所獲得色譜峰面積之比，考察樣品的絕對提取回收率，每個濃度平行測定5份。結果表明，蝙蝠葛堿在大鼠和人血漿中提取回收率較高，基本達到80%以上。蝙蝠葛堿和內標在大鼠和人血漿中的萃取回收率見表1（表中IS為內標）。

2.4.4 精密度和方法回收率考察 （1）透析外液精密度考察：按“2.4.2”項下方法操作，測定蝙蝠葛堿高、中、低（7.55、1.89、0.47μg·mL-1）濃度樣品，測定日內精密度和一周內3 d的日間精密度，每個濃度平行5份，結果見表2。（2）大鼠血漿精密度考察：按“2.4.2”項下方法測定蝙蝠葛堿高、中、低（7.55、1.89、0.47μg·mL-1）濃度樣品，測定日內精密度和一周內3 d的日間精密度，每個濃度平行5份，結果見表2。（3）人血漿精密度考察：按“2.4.2”項下方法測定蝙蝠葛堿高、中、低濃度（7.55、1.89、0.47 μg·mL-1）樣品，測定日內精密度和一周內3 d的日間精密度，每個濃度平行5份，結果見表2。

表1 蝙蝠葛堿和內標在大鼠和人血漿中的萃取回收率（%，n＝4）Tab 1 Extraction recovery rates of dauricine and IS in rat and human plasma（%，n＝4）

表2 精密度試驗結果Tab 2 Results of precision tests

2.4.5 蝙蝠葛堿穩定性考察 （1）蝙蝠葛堿在透析外液和透析內液中穩定性考察：按“2.4.2”項下方法配制蝙蝠葛堿高、低（7.55、0.47 μg·mL-1）濃度樣品，于4 ℃放置，分別于0、12、24、36 h取樣進行測定。結果，RSD＝2.63%，表明4℃條件下蝙蝠葛堿在透析外液中放置36 h穩定。（2）蝙蝠葛堿在大鼠血漿中的穩定性考察：按“2.4.2”項下方法，配制蝙蝠葛堿高、低（7.55、0.47 μg·mL-1）濃度樣品，于4℃放置，分別于0、12、24、36 h取樣進行測定。結果，RSD＝3.13%，表明4℃條件下蝙蝠葛堿在大鼠血漿中放置36 h穩定。（3）蝙蝠葛堿在人血漿中的穩定性考察：按“2.4.2”項下方法，配制蝙蝠葛堿高、低（7.55、0.47μg·mL-1）濃度樣品，于4 ℃放置，分別于0、12、24、36 h取樣進行測定。結果，RSD＝4.25%，表明4℃條件下蝙蝠葛堿在人血漿中放置36 h穩定。

2.5 透析膜物理吸附的考察

2.5.1 蝙蝠葛堿供試液的制備 稱取蝙蝠葛堿2.59 mg，用稀鹽酸溶解后用1 mol·L-1氫氧化鈉調節pH值至6～7，用PBS定容至250 mL，得10.36 μg·mL-1高濃度供試液；取高濃度供試液50 mL，用PBS定容至100 mL，得5.18 μg·mL-1的中濃度供試液；取高濃度供試液10 mL，用PBS定容至100 mL，得1.04 μg·mL-1低濃度供試液。

2.5.2 考察透析膜對藥物的物理吸附作用 先將透析袋預處理后在空白透析液中室溫浸泡24 h。取一端扎緊的透析袋，除去袋內外水分，透析袋內加入2 mL（V1）空白透析液，將其放人盛有20 mL（V2）含藥（藥物濃度為c1）透析液的廣口瓶中，4℃中放置36 h至其平衡，然后測定透析袋外的藥物濃度（c外）（n＝3）。透析膜對藥物的吸附率用下式計算：

結果，蝙蝠葛堿在高、中、低（10.36、5.18、1.04 μg·mL-1）濃度下的吸附率分別為4.1%，3.3%，1.61%，表明透析袋對蝙蝠葛堿幾無吸附作用。

2.6 大鼠血漿中平衡時間的考察及血漿蛋白結合率的測定[7]

試驗前先將透析袋預處理后在空白透析液中室溫浸泡24 h。取一端扎緊的透析袋，除去袋內外水分，精密吸取2 mL空白大鼠或人血漿加至透析袋中，扎緊袋口，懸浮于盛有20 mL含藥透析液的廣口棕色瓶中，調整透析袋位置使袋內外液面保持同一水平，并避免貼瓶壁，密封瓶口，置于4℃中放置，分別于6、12 h取透析袋內外樣品100μL，待測。待24 h透析結束時，吸取透析外液，加入三氯醋酸溶液，若有白色絮狀物出現，則證明有血漿蛋白漏出，該樣品作廢；無血漿蛋白漏出者，分別取透析袋內外樣品并測定藥物濃度，計算血漿蛋白結合率。血漿蛋白結合率的計算公式如下：

結果表明，蝙蝠葛堿在24 h時在大鼠或人血漿中透析已達到平衡；在高、中、低（10.36、5.18、1.04 μg·mL-1）濃度下，蝙蝠葛堿大鼠血漿蛋白結合率分別為（69.63±1.3）%、（68.64±1.10）%、（72.54±0.50）%，人血漿蛋白結合率分別為（82.10±1.00）%、（84.96±0.70）%、（78.79±0.6）%，經過t檢驗分析，同種屬內高、中、低濃度下無顯著性差異（P＞0.05）。表明在1.04～10.36 μg·mL-1濃度范圍內，蝙蝠葛堿的大鼠或人血漿蛋白結合率無濃度依賴性，蝙蝠葛堿具有中等偏強的血漿蛋白結合率。蝙蝠葛堿的大鼠和人血漿蛋白結合率測定結果見表3。

表3 蝙蝠葛堿的大鼠和人血漿蛋白結合率測定結果（n＝3）Tab 3 Results of binding rate of dauricine to rat and human plasma protein（n＝3）

經過t檢驗分析，比較蝙蝠葛堿在大鼠和人血漿中蛋白結合率，蝙蝠葛堿血漿蛋白結合率具有種屬差異性（P＜0.05），且人血漿蛋白結合率較大鼠血漿蛋白結合率高。

3 討論

目前，血漿蛋白結合率最常用的方法為平衡透析法，與其他方法比較，該方法具有簡單、快速和成本較低的特點，但同時也存在一些缺點，如通常平衡時間較長、血漿和藥物在37℃下長時間放置易不穩定或變質、透析膜可能對藥物存在吸附等問題。為克服血漿變質的問題，有許多選擇在低溫條件下（如4℃）進行試驗，本試驗在預試驗時發現蝙蝠葛堿在37℃條件下長時間放置（放置12 h）不穩定，血漿蛋白也易變質，故選擇在4℃條件下進行試驗。

本研究結果表明，蝙蝠葛堿在1.04～10.36 μg·mL-1范圍內，蝙蝠葛堿的大鼠或人血漿蛋白結合率無濃度依賴性，說明蝙蝠葛堿在該濃度下與血漿蛋白的結合未達到飽和。本課題組在前期的對蝙蝠葛堿在體實驗中研究發現，蝙蝠葛堿大鼠iv后半衰期期較長（約5～7 h），推測與其較高強度的血漿蛋白結合率有直接關系。

由于體外試驗條件（透析溫度、藥物濃度和緩沖液pH值等）均不能完全模擬藥物在體內的環境，故體外試驗結果不能完全代表藥物的體內血漿蛋白結合率，該結果可作為體內真實血漿蛋白結合率的參考?？蛇M一步進行體內實驗，研究蝙蝠葛堿在組織中（如血漿、心、肝、脾、肺、腎、腦等）的分布，比較藥物在血漿和組織中濃度差異，從而判斷其與血漿蛋白結合的程度，體內、外研究結果結合起來，結果將更為可靠。

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[3] 潘錫平，胡崇家.咸寧產編蝠葛生物堿成份分析[J].中藥材，1991，14（12）：31.

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