益生素雛雞新城疫疫苗免疫后局部黏膜組織T淋巴細胞數量變化

呂曉萍,趙良友,于學武,鄭世民

(1.東北農業大學動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心,黑龍江 哈爾濱 150040;3.遼寧省動物疫病預防控制中心,遼寧 沈陽 110164)

益生素是指通過攝入適量從而對宿主產生有益作用的活菌[1]。益生素不僅可通過消化道發揮有益作用;還可外用于同樣存在固有菌群的泌尿系統和皮膚。益生素的主要功能包括:保持正常菌群,對抗感染、抑制癌癥和刺激免疫系統[2]。同時,除具有調節正常菌群達到促進健康作用外,還具有免疫調節作用,增強機體免疫功能[3]。隨著養殖業的大規模發展,飼養者為了治療動物疾病而濫用抗生素,導致動物體內致病菌產生耐藥性,無法控制某些疾病的發展和蔓延。為改變這一現狀,人們著力尋找能夠替代抗生素的天然添加劑,以減少動物性食品中藥物的殘留。目前研究和使用最多的是各種益生素。益生素作為免疫增加劑、抗生素的替代劑和動物性食品的增重劑廣泛應用于養殖業。本試驗旨在通過對雛雞局部免疫組織T淋巴細胞數量變化的研究,從細胞水平上檢測局部黏膜組織細胞免疫功能變化,揭示雛雞飼喂益生素、益生素與ND疫苗聯合應用局部黏膜組織細胞免疫的變化規律。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡艾維因雛雞100只,雌雄各半,購自哈爾濱某孵化場。經雞傳染性囊病、雞馬立克病和雞傳染性支氣管炎等抗體檢測均為陰性。

1.2 產酶益生素 山東華爾康生物技術有限公司,生產批號為飼添字(2007)11178號,按產品說明使用。

1.3 新城疫疫苗 LaSota弱毒苗(Ⅳ系),哈藥集團生物疫苗有限公司,批號為200861,按產品說明使用。

1.4 試驗動物分組及處理 100只雛雞隨機分為益生素組(簡稱P組)、ND疫苗免疫組(簡稱V組)、益生素ND免疫組(簡稱P+V組)和對照組(簡稱N組)4組,每組25只雛雞,分別做如下處理:

P組雛雞分別于1日齡和18日齡連續灌服生理鹽水3 d,1次/d,并分別于10日齡和21日齡經點眼、滴鼻免疫新城疫弱毒苗,其中21日齡疫苗免疫劑量為10日齡的2倍。

P+V組雛雞除將V組的灌服生理鹽水改為灌服益生素外,其他處理與V組相同。

N組雛雞分別于1日齡和18日齡連續灌服生理鹽水3 d,1次/d,為正常對照。

1.5 試驗材料的采取及處理 N、P、V、P+V組雛雞分別于疫苗首次免疫后第0、7、14、28天和第42天,每組隨機抽取5只雛雞,心臟采血處死,快速采取哈德爾氏腺、盲腸扁桃體、十二指腸和回腸派伊爾結固定于4℃預冷的4%甲醛蔗糖緩沖液中,冰箱4℃固定24 h。

1.6 檢測指標及方法 (1)切片制備:固定組織經流水沖洗后,分別于 70%、80%、90%、100%Ⅰ和100%Ⅱ丙酮逐級脫水(時間依組織塊大小從30 min～60 min)、二甲苯透明、常規石蠟浸透、包埋和制片。(2)T細胞檢測:盲腸扁桃體、哈德爾氏腺、十二指腸和回腸派伊爾結 T細胞數量檢測應用ANAE染色法。(3)鏡檢計數:參考 Timo romppanen格點計數法[4],油鏡檢查免疫組織特定區域5個視野中的T細胞數量,以×103細胞/mm2表示。

1.7 數據處理 采用SPSS 13.0軟件進行數據處理,比較各組間差異。

2 結果

2.1 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體T細胞數量變化

2.1.1 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體彌散區T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體彌散區 T細胞數量分別于第14天、第7～14天和第7～28天明顯高于ND疫苗單獨免疫雛雞、益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);益生素雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞上述被檢指標于免疫后7～28 d明顯高于對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞又于7～14 d高于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統計學差異(P＞0.05)(表1)。

表1 益生素ND免疫雛雞扁桃體彌散區T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.1.2 益生素雛雞ND疫苗接種后盲腸扁桃體淋巴小結T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體淋巴小結T細胞數量分別于第14天、第 7～14在和第7～28天明顯高于ND疫苗單獨免疫雛雞、益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);益生素雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞上述被檢指標于7～28 d顯著或極顯著高于對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞于免疫后7～17 d多于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統計學差異(P＞0.05)(表2)。

2.2 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺T細胞數量變化

2.2.1 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺分泌管周圍T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺分泌管周圍T細胞數量分別于第14天和第7～28天較益生素雛雞和對照雛雞顯著增多(P＜0.05或P＜0.01),益生素雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞分別于第14天和第7～28天明顯高于對照雛雞(P＜0.05或 P＜0.01),ND疫苗單獨免疫雛雞于免疫后第14天極顯著高于益生素雛雞(P＜0.01);其余未見統計學差異(P＞0.05)(表3)。

表2 益生素ND免疫雛雞盲腸扁桃體淋巴小結T細胞數量變化 (×103個/mm2)

表3 益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺分泌管周圍T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.2.2 益生素雛雞ND疫苗接種后哈德爾氏腺集合管周圍T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺集合管周圍T細胞數量于第14天極顯著高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞分別于免疫后第14天和第14～28天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01),其余未見統計學差異(P＞0.05)(表4)。

表4 益生素ND免疫雛雞哈德爾氏腺集合管T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.3 益生素雛雞ND疫苗接種后腸派伊爾結T細胞數量變化

2.3.1 益生素雛雞ND疫苗接種后十二指腸派伊爾結T細胞數量變化 雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞十二指腸派伊爾結T細胞數量分別于第14天和第14～28天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞分別于免疫后第14天和第7～14天顯著或極顯著高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01),其余未見統計學差異(P＞0.05)(表5)。

表5 益生素ND免疫雛雞十二指腸派伊爾結T細胞數量變化 (×103個/mm2)

2.3.2 益生素雛雞ND疫苗接種后回腸派伊爾結T細胞數量變化 雛雞接種 ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞回腸派伊爾結 T細胞數量分別于第14天和第7～28天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01);ND疫苗單獨免疫雛雞分別于免疫后第14天和第7～14天明顯高于益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.01),其余未見統計學差異(P＞0.05)(表6)。

3 討論

益生素是良好的免疫增強劑,可提高機體細胞免疫和體液免疫,增強機體抵抗力[5]。在動物飼料中添加益生素,可促進機體免疫器官發育,提高T、B細胞數量,增強機體對抗原產生免疫反應,還可激活巨噬細胞、單核細胞等活性細胞分泌細胞因子,增強機體的抗病力[6]。研究發現[7],雙歧桿菌可促進免疫活性細胞表面IL-6、IL-10和IFN-α等細胞因子的表達;應用乳酸桿菌和芽孢桿菌后,動物腸道黏膜底層細胞增加,淋巴細胞、巨噬細胞,自然殺傷性細胞的吞噬功能增強,分泌多種細胞因子,如IL-4、IL-6和IL-10等可促進SIgA合成,使腸道免疫屏障作用增強,從而提高機體抵抗感染能力[8]。

表6 益生素ND免疫雛雞回腸派伊爾結T細胞數量變化 (×103個/mm2)

試驗結果發現,雛雞接種ND疫苗后,益生素ND免疫雛雞和ND疫苗單獨免疫雛雞的哈德爾氏腺、盲腸扁桃體和回腸派伊爾結 TANAE+細胞數量分別于免疫后第14天、第7～14天和第7～28天明顯高于未接種疫苗的益生素雛雞和對照雛雞(P＜0.05或P＜0.01)。表明ND疫苗接種提高了機體消化道局部黏膜的細胞免疫水平。產生上述變化的原因可能是:弱毒疫苗作為抗原進入機體后,首先被以巨噬細胞為主的抗原提呈細胞捕獲,一方面對其加工處理,濃集抗原決定簇于細胞表面;另一方面分泌細胞因子IL-1,在MHCⅡ類分子作用下,輔助性Th細胞(CD4+)識別并接受相應抗原決定簇和IL-1刺激,活化淋巴母細胞,使T細胞數量增加。致敏的Th細胞表達IL-2受體,同時釋放多種細胞因子,如 IFN-γ、IL-6、IL-10和 IL-13等,參與細胞免疫。未接種疫苗的雛雞,因沒有受到外源性抗原(弱毒疫苗)的刺激,機體局部免疫組織的T細胞并不致敏活化,不會大量增殖和分化,T細胞數量較接種了ND疫苗的雛雞沒有明顯的增加趨勢。

試驗結果還發現,ND疫苗免疫42 d,益生素雛雞上述免疫組織的TANAE+細胞數量不同程度高于未服用益生素的對照雛雞,但無統計學差異(P＞0.05)。表明益生素可促進免疫器官發育和激發雛雞局部黏膜組織的細胞免疫。產生上述變化的主要原因可能是:(1)益生素作為活菌制劑在雛雞腸道表面定植與繁殖,當其增殖至一定數量時,可刺激機體免疫組織發育和免疫應答。(2)益生素在腸道內繁殖,不斷合成免疫器官組織發育不可缺少的維生素和氨基酸等營養物質。(3)益生素自身組成成分,如脂多糖、肽聚糖和DNA等大分子釋放到機體腸道內,直接刺激機體免疫器官發育和激發機體免疫應答。(4)益生素作為免疫增強劑作用于機體,活化了腸黏膜內相關淋巴組織,使腸道黏膜底層細胞增加,呈現淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞浸潤,增強機體局部免疫功能。試驗結果發現,益生素ND聯合應用雛雞的局部黏膜免疫組織TANAE+細胞數量均不同程度高于ND疫苗單獨免疫雛雞。其中益生素ND聯合應用雛雞盲腸扁桃體在免疫后第14天顯著高于ND單獨免疫雛雞(P＜0.05)。表明益生素與ND疫苗聯合使用,增強了雛雞局部黏膜的細胞免疫功能和對ND疫苗的免疫應答。產生這種變化的原因可能是:益生素中含有芽孢桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌等,它們和弱毒疫苗抗原一樣,作為外源性物質,共同刺激機體的局部黏膜免疫系統,使機體產生更強的免疫應答反應,也增強了機體對ND疫苗的免疫應答。

病原體侵染機體時,首先要突破機體與外界環境的屏障-黏膜表面。ND局部免疫部位也是NDV入侵門戶,因此,通過黏膜途徑激發的黏膜免疫在ND免疫中具有重要地位。益生素與ND疫苗聯合應用提高ND疫苗的局部細胞免疫水平,在ND防治中有嚴重意義。

[1]Sleator R D.New frontiers in probiotic research[J].Lettapp Microbiol,2008,46(2):143-147.

[2]Viana J V,Cruz A G,Zoelln er S S,et al.Probiotic foods:consumer percep tion and attitudes[J].Int J Food Sci Technol,2007,43(9):1577-1580.

[3]龔非力.醫學免疫學[M].3版.北京:科學出版社,2009:11.

[4]T imo Rom ppan en.Postembryonic developmen tof chicken bu rsa of Fab ricius:A light microscopic hist qu an titative study[J].Poultry S ci,1982,61:2261-2270.

[5]Deb bie M.Probiotics[J].Journal of Exotic Pet Medicine.2007,16(3):195-197.

[6]Francesca G,Paola M,Bruno B.Probiotics and prebiotics in animalfeeding for safe food production[J].International Jou rnalof Food Microbiology,2010,141(131):S15-S 28.

[7]胡迎利,趙燕飛,汪以真.腸道菌群對動物免疫的影響[J].中國獸醫雜志,2005,41(8):62-65.

[8]范駿.腸道黏膜免疫[J].國際免疫學雜志,2006,29(2):111-115.