銅離子對海參精氨酸激酶活力與結構的影響

劉陶陶, 王希成,2

（1. 清華大學 生命科學院, 北京 100084; 2. 清華大學生命科學院 蛋白質科學教育部重點實驗室, 北京 100084）

銅離子對海參精氨酸激酶活力與結構的影響

劉陶陶1, 王希成1,2

（1. 清華大學 生命科學院, 北京 100084; 2. 清華大學生命科學院 蛋白質科學教育部重點實驗室, 北京 100084）

精氨酸激酶（Arginine kinase, EC2.7.3.3）是無脊椎動物能量代謝所必需的重要的酶。海參精氨酸激酶是一種特殊的雙亞基精氨酸激酶。本文研究了在二價銅離子作用下, 海參精氨酸激酶催化活性與結構的變化。結果表明, 一定濃度的銅離子, 可以抑制精氨酸激酶的活力, 并引起酶二級結構與三級結構的變化, 引起疏水面暴露, 并導致酶的聚集。銅離子對精氨酸激酶的抑制作用與鎂離子等其他二價金屬離子有明顯不同。

精氨酸激酶（Arginine kinase, EC2.7.3.3）; Cu2+; 聚沉; 去折疊

磷酸原激酶是一大類酶, 能夠催化 ATP與生物體內天然存在的一些胍基底物之間可逆的轉磷?；磻? 分別生成相應的磷酸胍基化合物用以儲存ATP上高能磷酸鍵的能量, 多位于動物能量消耗和能量波動比較大的部位[1]。精氨酸激酶（Arginine kinase, EC2.7.3.3）是磷酸原激酶家族的成員之一, 精氨酸激酶是無脊椎動物中最為廣泛存在的一種磷酸原激酶, 催化ATP與精氨酸之間γ-磷酸基團的可逆性交換, 生成ADP和磷酸精氨酸。在組織的ATP供應充足時, 可將能量存儲在磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中, 當組織消耗大量能量時, 為及時補充能量則催化磷酸精氨酸分解, 用以補償 ATP濃度的劇烈變化[2]。精氨酸激酶主要以分子質量約為40 ku的單體形式存在, 某些棘皮動物如海參、海膽中的精氨酸激酶為特殊的雙體結構, 分子質量約 80 ku, 由兩個相同的亞基構成[3]。在磷酸原激酶家族中, 對于其他物種來源的單體精氨酸激酶和存在于脊椎動物中的肌酸激酶（Creatine kinase） 研究的較為詳盡, 而對于雙亞基海參精氨酸激酶的研究比較少。

以往對磷酸原激酶家族的研究中, 已經證實鋅離子和銅離子等重金屬離子可以影響肌酸激酶的催化功能與結構, 并影響酶的折疊過程[4-5]。銅是生物體發揮正常生理功能所必須的微量元素, 但過量的銅離子對于機體具有毒性, 由于銅離子的氧化還原活性, 推測過量的銅對機體的損害可能有: 引起生物大分子的氧化, 導致蛋白質或 DNA的損傷, 催化ROS（reactive oxygen species）的形成, 結合于蛋白質上引起蛋白聚集等[6-8]。精氨酸激酶是海參能量代謝所必需的酶, 將它作為模式蛋白, 從生物化學的角度研究過量的銅離子對酶的抑制作用, 對于闡明酶的結構與功能的關系具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用質粒pET21b與大腸桿菌BL21/DE3,購于Novagen公司; ATP、精氨酸、Tris、isopropylβ-D-thiogalactopyranoside （IPTG）、1-anilinonaphtalene-8-sulfonate（ANS）, 購自 sigma公司;親和層析鎳柱 Ni2+-NTA, 購自上海申能博彩公司; 實驗所用二價銅離子標準溶液用CuCl2配制, 購自Fluka;用超純水配制 30 mmol的銅離子標準儲液, 采用容量瓶定容, 在實驗中稀釋到相應的終濃度。其他試劑都為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 酶的表達純化

編碼海參精氨酸激酶的基因已經由本實驗室克隆到質粒pET21b上, 構建了pET21b-AK載體, 可在大腸桿菌BL21/DE3中可溶性表達[9]。為了便于表達純化, 在 C末端加上 His-tag。挑取單菌落在含50μg/mL 氨芐青霉素的新鮮 LB培養基中經 37℃過夜培養, 二次培養轉接至同樣的LB培養基中待OD值達到0.6左右, 加入0.4 mmol 的IPTG （isopropylβ-D-thiogalactopyranoside） , 在25℃的條件下培養14 h,以誘導重組蛋白的表達。使用Ni2+-NTA鎳柱進行酶的分離純化, 根據說明書進行操作。收集菌體破碎細胞, 離心取上清液, 與鎳柱結合, 用含有梯度濃度咪唑的緩沖液洗脫蛋白。純化的蛋白經 SDS-PAGE電泳鑒定為均一的一條帶。從大腸桿菌的海參精氨酸激酶, 比活與電泳遷移率都與從海參肌肉中提取的精氨酸激酶基本一致[9]。

1.2.2 酶濃度的測定

酶濃度的測定采用 Bradford考馬斯亮藍 G-250法, 以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白做標準曲線。

1.2.3 酶活力的測定

采用改進的 pH比色法[10]測定精氨酸激酶的活性, 反應體系中含有5.7 mmol精氨酸, 4.8 mmol ATP,6.6 mmol乙酸鎂, 復合酸堿指示劑（麝香草酚藍-甲基紅）, 20 mmol Tris-乙酸, pH 8.0。測定活力時, 1 mL反應液加入光徑1 cm的塑料比色杯中, 加入10 μL的精氨酸激酶啟動反應, 測定 575 nm 處光吸收值在30 s之內的變化?；盍y定在Specord 200 UV Vis分光光度計（Jena, 德國）上進行。

失活動力學常數的計算采用半對數作圖法[11],若為一級反應, 失活速率常數k可由速率方程lnA=?kt求得, 其中A代表酶活,t是失活時間。

1.2.4 光譜實驗

遠紫外CD光譜測定是在Jasco –J500C型圓二色性色譜儀上進行, 測定波長范圍為190～260 nm, 吸收池光徑為1 mm, 每個樣品掃描3次取平均值。

熒光光譜都通過熒光儀Hitachi 850 spectrofluorimeter測得。內源熒光的激發波長為295 nm。掃描范圍設定300～400 nm。用ANS作為外源熒光探針,測定實驗中樣品的疏水表面暴露情況, 將樣品與ANS按照1 : 50的摩爾比在室溫下避光作用30 min后, 進行400～600 nm處的熒光掃描。激發波長設定為380 nm。

1.2.5 聚沉實驗

聚集實驗是用Specord 200 UV Vis分光光度計（Jena, 德國）于室溫下通過監測 400 nm處吸光度的變化來反映該過程中濁度的變化。

實驗中除特別注明, 一般酶的終濃度為10μmol/L, 緩沖液為 20 mmol/L Tris-Ac （pH 8.0）, 溫度為25℃, 反應時間1 h。

2 結果

2.1 海參精氨酸激酶剩余活力的變化

將海參精氨酸激酶與不同濃度的 Cu2+,在 25 ℃作用1 h后測定精氨酸激酶的剩余活力。如圖1所示,低濃度的 Cu2+即可導致精氨酸激酶活力的迅速下降。在0～1 mmol/L濃度范圍之間, 隨著Cu2+濃度的增加, 精氨酸激酶的活力出現迅速的降低。當 Cu2+的濃度增加到1 mmol/L時, 精氨酸激酶的剩余活力減少到只有天然狀態的 32%。當 Cu2+濃度增加到4 mmol/L時, 精氨酸激酶活力繼續緩慢降低到低于天然狀態的2%, 僅有極少部分活力。從不同濃度的Cu2+對于精氨酸激酶活力影響結果可見, 二價銅離子對精氨酸激酶有明顯的活力抑制作用。而在同樣條件下同等濃度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+等二價金屬離子則不會使精氨酸激酶出現失活（數據未提供）。進一步改變不同的銅離子濃度, 監測精氨酸激酶活力隨時間的變化過程, 可以發現, 精氨酸激酶在 Cu2+作用下, 隨著 Cu2+濃度的升高, 精氨酸激酶失活的速度也會加快。通過不同時刻取樣, 測量酶的剩余活力,將剩余活力取對數對反應時間作圖, 結果見圖2。由內插圖可以判斷該反應為一級動力學雙相反應, 該過程分為快相與慢相兩部分, 分別對快相部分和慢相部分進行線性擬合, 根據斜率可求出慢相部分的失活常數k2, 用快相減去慢相的變化可得到扣除慢相反應后快相的失活常數k1。其中k1隨Cu2+濃度增加而增大, 而k2變化不明顯, 結果如表1所示。

圖1 不同濃度Cu2+對精氨酸激酶活力的影響Fig. 1 Effect of Cu2+on the residual activity of AK

圖2 加入Cu2+后精氨酸激酶失活隨時間變化的曲線Fig. 2 Kinetic course of AK inactivation induced by Cu2+

表1 Cu2+處理精氨酸激酶的失活動力學Tab. 1 Inactivation rate constants of AK in the presence of Cu2+

2.2 海參精氨酸激酶二級結構的變化

利用遠紫外 CD光譜可以反映蛋白質二級結構的變化。將不同濃度的銅離子與精氨酸激酶反應1h,然后測CD光譜。如圖3所示, 在0～3 mmol/L濃度范圍內, 隨著Cu2+濃度的增加, 222 nm和208 nm處的兩個負峰, 峰值有一定程度的下降。說明Cu2+對精氨酸激酶的二級結構有一定的影響。

內源熒光光譜的結果（圖4）表明, 在 Cu2+的作用下, 精氨酸激酶的熒光最大發射波長出現了輕微的紅移, 從天然狀態的329 nm紅移至332.5 nm。表明Cu2+對精氨酸激酶的三級結構有一定程度的影響,使精氨酸激酶的結構變得略微松散。同時, 隨著Cu2+濃度的增加, 內源熒光的強度也隨之降低, Cu2+對精氨酸激酶的結合可能導致熒光生色基團的疏水微環境發生了變化, 而使得熒光強度有所降低。

圖5是用0～3 mmol/L不同濃度的Cu2+處理精氨酸激酶。結果顯示精氨酸激酶的 ANS外源熒光強度明顯增高, 最大熒光發射峰位藍移, 表明在 Cu2+的作用下精氨酸激酶的疏水面暴露程度增加了, 并且隨著Cu2+的濃度增加而加大。

圖6比較了用同濃度的 Cu2+和其他幾種不同的二價金屬離子處理精氨酸激酶之后, 疏水表面的暴露程度。從圖中結果可以看出, 室溫下3 mmol/L的Cu2+的作用使得精氨酸激酶的ANS熒光強度大大增強, 而同樣濃度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+則沒有引起精氨酸激酶疏水面的明顯暴露。

圖3 精氨酸激酶的圓二色光譜Fig. 3 Far-ultraviolet CD spectra of AK

圖4 精氨酸激酶的內源熒光光譜Fig. 4 Intrinsic fluorescence emission spectra of AK.曲線1-5 Cu2+濃度與圖3相同

2.3 聚沉的結果

通過400 nm處濁度的變化來檢測Cu2+對精氨酸激酶的聚集作用。圖7是常溫下用不同濃度的Cu2+處理酶之后, 精氨酸激酶的聚集變化。結果顯示,Cu2+可以使精氨酸激酶出現明顯的聚集, 低于1mmol/L的 Cu2+對精氨酸激酶的聚集速度比較慢,A400nm濁度緩慢增加。高于1 mmol/L的Cu2+對精氨酸激酶的聚集作用非常顯著, 且聚集的程度隨著Cu2+濃度的增加而加劇。Cu2+對精氨酸激酶的聚集也是有濃度依賴性的, 如圖8所示, 隨著Cu2+濃度的增加精氨酸激酶聚集的更為明顯。而在同樣條件下同等濃度的 Mg2+、Ca2+、Mn2+等二價金屬離子則不會使精氨酸激酶出現聚集現象（數據未提供）。

圖5 精氨酸激酶的ANS熒光光譜Fig. 5 ANS-binding fluorescence spectra of AK

圖6 幾種不同的二價金屬離子對精氨酸激酶作用的ANS熒光光譜Fig. 6 ANS-binding fluorescence spectra of AK for different divalent ions.

3 討論

在生物學的研究中, 關于蛋白質結構與功能的關系的研究一直是一個重要的核心問題。對于酶來說, 構象的完整性以及折疊的正確與否是其發揮生理功能的基礎。以往對于酶的研究中, 利用胍、脲等變性劑對酶進行折疊與去折疊已經做了很多工作,但是關于金屬離子對蛋白質結構和穩定性的影響這方面的研究還不是很多。

圖7 不同濃度Cu2+對精氨酸激酶的聚集影響Fig. 7 Aggregation time course of AK induced by Cu2+at different concentrations.

圖8 5 mmol/L Cu2+對不同濃度精氨酸激酶的聚集影響Fig. 8 Aggregation time course of AK induced by 5 mmol/LCu2+at different concentrations of enzyme

從實驗結果可知, 常溫下低濃度的 Cu2+即可引起精氨酸激酶的活力迅速降低, 并隨著 Cu2+濃度的增加而持續降低, 增加 Cu2+的濃度會導致精氨酸激酶失活的速率也有所增加。動力學結果表明 Cu2+對精氨酸激酶的失活是雙相過程, 分為快相和慢相兩部分。CD光譜結果顯示, 隨著Cu2+濃度的增加, 峰值出現一定程度的下降, 證明二級結構在 Cu2+的誘導下發生了變化,α-螺旋含量減少。與Cu2+對精氨酸激酶作用后剩余活力的結果相比, 在該濃度范圍內,精氨酸激酶的活力也是迅速降低的, 提示精氨酸激酶催化活力的降低是由于結構的改變。內源熒光的結果表明, 在 Cu2+的誘導下, 精氨酸激酶的三級結構也發生了細微的變化, 最大熒光發射波長出現了一定程度的紅移, 并伴隨著熒光強度的降低。說明在Cu2+的作用下, 精氨酸激酶的三級結構變得有些疏松, 熒光生色基團所處的疏水微環境發生了變化而導致酶的內源熒光強度下降。CD和熒光的結果暗示Cu2+對精氨酸激酶的作用可能導致了其的部分去折疊。

ANS是一種疏水探針, 可與蛋白質中的疏水區域結合導致熒光產率的大大增加。這一特性可以用來檢測蛋白疏水表面的暴露情況。ANS的熒光強度變化表明, 在 Cu2+的作用下, 精氨酸激酶表面的疏水面暴露增加, 而疏水相互作用是在蛋白折疊和再折疊過程中誘導聚集的主要原因。疏水面的暴露可能是導致Cu2+誘導精氨酸激酶聚集的主要原因。

在聚集的實驗中, 在一定濃度 Cu2+作用下, 結果顯示 Cu2+誘導精氨酸激酶的聚集趨勢是隨著Cu2+濃度的增加而增加, 并且是酶濃度依賴性的。在無其他變性條件下, Cu2+即可導致精氨酸激酶出現疏水面的暴露, 導致聚集的發生。而其他幾種二價金屬離子在同樣條件下不會引起精氨酸激酶的聚集, 作為重金屬離子的 Cu2+對精氨酸激酶的抑制和誘導聚集的現象, 和 Mg2+、Ca2+、Mn2+等其他二價金屬離子不同, 這可能與Cu2+特殊的化學性質有關。

本研究結果表明, 過量的 Cu2+對海參精氨酸激酶有明顯的抑制作用, 可導致蛋白的失活與聚集, 并干擾酶的折疊過程, 具體的機制還需要進一步研究。

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Received: Jun., 25, 2010

Key words:Arginine kinase; Cu2+; aggregation; unfolding

Abstract:Arginine kinase （AK） plays an important role in the cellular energy metabolism of invertebrate. AK from sea cucumberStichopus japonicusis dimeric. The effects of Cu2+on AK were studied by measuring activity changes, kinetic time course of inactivity, far-UV circular dichroism spectra, fluorescence spectra, and turbidity changes at 400nm. These results suggested that Cu2+caused AK inactivation accompanied by conformational change, exposure of hydrophobic surface, and aggregation. The effects of Cu2+on AK are distinctive compared with other metal divalent ions.

（本文編輯:康亦兼）

Effects of Cu2+on Arginine kinase: activity changes, conformational changes, and aggregation

LIU Tao-tao1, WANG Xi-cheng1,2
（1. School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China; 2. Protein Science Laboratory of the Ministry of Education, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China）

Q518.4

A

1000-3096（2011）01-0017-05

2010-06-25;

2010-09-07

劉陶陶（1973-）, 女, 山東濟南人, 博士研究生, 主要從事生物化學與分子生物學研究, 電話: 010-62783958, E-mail: liutaotao@tsinghua.org.cn; 王希成, 通信作者, 電話: 010-62783958, E-mail:wangxic@mail.tsinghua.edu.cn