乙酰肝素酶、堿性成纖維細胞因子與非小細胞肺癌血管生成及轉移的關系

劉 健，馬敏杰，韓 彪，魏 寧

（蘭州大學第一醫院胸外科，甘肅 蘭州 730000）

乙酰肝素酶、堿性成纖維細胞因子與非小細胞肺癌血管生成及轉移的關系

劉 健，馬敏杰，韓 彪，魏 寧

（蘭州大學第一醫院胸外科，甘肅 蘭州 730000）

乙酰肝素酶；堿性成纖維細胞因子；非小細胞肺癌；腫瘤轉移

全世界每年約有131萬人死于肺癌，我國是肺癌高發區，因肺癌死亡者僅次于胃癌，居第二位。腫瘤血管新生、浸潤和轉移是影響非小細胞肺癌預后的重要因素[1]。堿性成纖維細胞因子（BFGF）是目前所知的最重要的促血管生長因子，在腫瘤血管新生中起重要作用。非小細胞肺癌中普遍存在BFGF的高表達，并且和較差的預后[2]、腫瘤進展[3]、血管新生[4]、淋巴浸潤和轉移[5]相關。在腫瘤血管新生、浸潤和轉移過程中，不斷伴隨著新蛋白的合成。這些新蛋白不但為腫瘤細胞增殖、生長所必需，對于血管內皮細胞的增殖也很重要。因此，作為蛋白翻譯起始所必需的mRNA帽結合蛋白，乙酰肝素酶（HPs）與腫瘤的血管新生[6]、惡性轉化和轉移[7]密切相關。HPs表達升高能促進一系列血管新生相關蛋白如BFGF的翻譯，因此我們推測：非小細胞肺癌中BFGF和HPs的表達存在著相關性，并且和非小細胞肺癌的分化、分期、血管新生、浸潤和轉移相關。筆者通過檢測131例非小細胞肺癌組織中HPs、BFGF的表達，以探討其在非小細胞肺癌的發生、發展及轉移中的作用，并分析2者的相互關系，以便為非小細胞肺癌的早期診斷、有效治療及預后提供重要的科學依據。

1 材料及方法

1.1 研究對象

131例組織標本全部取自蘭州大學第一醫院胸外科2000～2008年資料完整的住院手術患者，患者均經病理證實為非小細胞肺癌，年齡40～73歲，男94例，女37例。所有患者術前均未接受化療、放療或針對腫瘤的治療，均在全麻下行非小細胞肺癌切除術。131例非小細胞肺癌中高分化癌39例，中分化癌75例，低分化癌17例，全部病例按照國際抗癌聯盟（UICC）1997年分期標準進行分期，浸潤深度：Ti 6例，T110例，T244例，T358例，T413例；淋巴分期：N044例，N187例；遠處轉移：M0101例，M130例；臨床分型：0期1例，Ⅰ期7例，Ⅱa期13例，Ⅱb期51例，Ⅲ期44例，Ⅳ期15例。正常對照組織全部取自手術時切除的、距瘤體約10 cm、均經病理證實為正常的肺組織。

1.2 標本處理

所有標本均經100 mol/L甲醛液固定，常規石蠟包埋，制備成4 μm厚的連續切片5張，1張行蘇木精-伊紅染色，其余切片貼附于經防脫處理的載玻片上，60℃干燥72 h后，用于不同的免疫組織化學染色。

1.3 實驗方法

1.3.1 蘇木精-伊紅染色 切片進行常規蘇木精-伊紅染色。

1.3.2 免疫組織化學染色方法 本實驗采用S-P染色法檢測HPs、BFGF和CD34在各標本上的表達。S-P試劑盒，購自福州邁新生物技術開發公司。將切片進行免疫組織化學標記，3%雙氧水室溫浸泡5 min，蒸餾水洗，PBS浸泡5 min。5%～10%正常羊血清，室溫孵育10 min，傾去血清后加入適當稀釋的一抗HPs（鼠單抗，554R16，ABCAM）、BFGF（兔單抗，Santacruz）或 CD34（MAB-0034），37℃孵育 60 min，PBS浸泡 5 min，共 3次。滴加生物素標記的二抗37℃孵育15 min，PBS浸泡5 min，共3次。滴加辣根酶標記的鏈霉卵白素37℃孵育15 min，PBS浸泡3 min，共3次。DAB顯色，水洗后，蘇木精復染，分色，返藍，脫水，透明封固。以PBS代替第一抗體為陰性對照。

1.3.3 觀察指標（1）HPs陽性判定標準：HPs、選染色均勻的區域，顯微鏡下隨機選擇10個高倍視野計數，陽性細胞數<10%為陰性，≥10%為陽性。切片中癌組織陽性染色弱，陽性范圍＜50%癌組織面積者判定為（＋）；染色弱，陽性范圍＞50%判定為（＋＋）；染色強，陽性范圍＜ 50%判定為（＋＋＋）；染色強，陽性范圍＞50%判定為（＋＋＋＋）。并將染色強度（+）～（＋＋）劃分為低表達，（＋＋＋）～（＋＋＋＋）劃分為高表達[8]。

（2）BFGF陽性判定標準：對BFGF標記切片，采用 Eastham等[9]的方法。即切片中癌組織陽性染色弱，陽性范圍＜癌組織面積 50%者判定為（＋）；染色弱，陽性范圍＞50%判定為（＋＋）；染色強，陽性范圍＜50%判正為（＋＋＋）；染色強，陽性范圍＞50%判定為（＋＋＋＋）。并將染色強度（+）～（＋＋）劃分為低表達，（＋＋＋）～（＋＋＋＋）劃分為高表達[8]。以腫瘤細胞胞質內出現棕黃色顆粒為陽性判定標準。

（3）CD34陽性判定標準：在低倍視野下選取腫瘤微血管數量（CD34陽性）最豐富區域，在200倍視野范圍計 5個視野的微血管數目，取平均值作為腫瘤微血管密度（MVD）；以血管內皮細胞胞質內出現棕黃色顆粒為陽性判定標準。

1.4 統計學分析

應用統計軟件SPSS 13.0分析資料，計數資料采用χ2檢驗、方差分析，計量資料采用t檢驗，應用Log-Rank檢驗比較不同組別患者的生存時間。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌及正常肺組織中HPs、BFGF、MVD的表達

131例非小細胞肺癌組織中，HPs陽性105例（80.2%），BFGF陽性99例（75.6%）。20例正常肺組織中未見HPs陽性表達，6例BFGF陽性表達。非小細胞肺癌組織中HPs和BFGF的表達陽性率顯著高于正常肺組織（P<0.01）。非小細胞肺癌中MVD計數為（30.59±13.38）個，顯著高于正常肺組織的MVD計數（13.82±4.16）個（見表 1）。

表1 HPs、BFGF和MVD在非小細胞肺癌和正常肺組織中的表達

2.2 HPs、BFGF和MVD的表達與非小細胞肺癌分化程度的關系（見表2）

HPs在高、中、低分化非小細胞肺癌中陽性率分別為：66.7%、84.0%、94.1%（P＜0.05）；BFGF 在高、中、低分化非小細胞肺癌中陽性率分別為：74.4%、78.7%、64.7%（P＞0.05）；MVD 在高、中、低分化非小細胞肺癌中分別為：33.13±7.93、31.92±5.29、32.52±6.17（P＞0.05）。本研究提示HPs基因過度表達隨惡性度增加而升高，從而證實HPs有使細胞惡性轉化的能力。而BFGF、MVD在非小細胞肺癌中的表達與非小細胞肺癌分化程度無關。

2.3 HPs、BFGF和MVD的表達與非小細胞肺癌臨床分期的關系（見表2）

HPs在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中陽性率分別為：73.6%、88.1%（P＜0.05）。BFGF在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中陽性率分別為：68.1%、84.7%（P＜0.05）。MVD在0+Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期中分別為：35.95±5.19、43.19±7.15（P>0.05）。由此說明，HPs、BFGF 在非小細胞肺癌中的表達與臨床分期顯著相關（P＜0.05），非小細胞肺癌組織中MVD與臨床分期無相關性（P>0.05）。

2.4 HPs、BFGF和MVD的表達與非小細胞肺癌淋巴結轉移M分期的關系（見表2）

表2顯示，HPs、BFGF在非小細胞肺癌中的表達與非小細胞肺癌淋巴結轉移M分期情況呈顯著相關性，非小細胞肺癌組織中MVD與非小細胞肺癌淋巴結轉移情況無顯著相關性。

2.5 HPs 與BFGF在非小細胞肺癌中的關系

HPs在本組非小細胞肺癌中的表達與BFGF的表達有顯著性差異（r=0.553，P=0.000），同時，HPs與 BFGF 在本組非小細胞肺癌中的表達與MVD有顯著性差異（P=0.000）。

2.6 不同HPs表達水平對非小細胞肺癌患者生存時間的影響（見表 3、圖 1）

根據HPs的表達水平將131例患者分成3組，采用Ka－Plan-meier方法描繪3組的生存曲線，用Log-Rank檢驗比較3組生存時間，3組之間有極顯著性差異（P＜0.001）。

表2 HPs、BFGF和MVD在非小細胞肺癌中的表達

表3 Log-Rank檢驗比較3組生存時間

圖1 不同HPs表達水平的非小細胞肺癌患者生存曲線

2.7采用Cox風險比例模型預測影響非小細胞肺癌預后的因素（見表 4）

表4 影響非小細胞肺癌預后的因素分析

采用Cox風險比例模型，擬對131例非小細胞肺癌患者臨床病理因素及癌組織中HPs、BFGF、MVD的表達強度進行預后多因素分析。由表4可知HPs的表達程度、遠處轉移及非小細胞肺癌淋巴結轉移是非小細胞肺癌術后影響患者生存時間的危害性因素。

3 討論

人類乙酰肝素酶基因位于第4條染色體上，有12個外顯子，11個內含子，編碼區總跨度為39 113個核苷酸，編碼區上游2.3 kb區包含一啟動子。結構完整的人類乙酰肝素酶CDNA是一個由543個氨基酸殘基切除后，形成一個同上C端386個氨基酸殘基組成的活性很強的成熟蛋白，分子量約為50 kDa；并且這種前體酶的水解激活是所有參與ECM蛋白降解及細胞浸潤酶類的共同特征。同一種族的不同組織細胞間，如人的胎盤、血小板、轉移的腫瘤細胞等也表達同一種乙酰肝素酶。癌癥的轉移是癌細胞從癌組織中突破胞外基質的限制，轉移擴散到別的器官并繼續增殖所造成的。癌癥成為致命的疾病，不僅在于癌細胞的生長失去控制，更在于其轉移能力。在轉移過程中，細胞粘附、細胞運動、ECM的降解及血管生成是腫瘤轉移的決定性因素，在本研究中乙酰肝素酶及堿性成纖維細胞生長因子在非小細胞肺癌組織中的表達與腫瘤的浸潤及轉移密切相關（P<0.001）。同時，與微血管密度在非小細胞肺癌組織中的表達密切相關，本實驗結果及相關資料表明乙酰肝素酶及堿性成纖維細胞生長因子的表達與腫瘤細胞轉移潛能密切相關。

非小細胞肺癌中普遍存在BFGF的高表達，并且和較差的預后[2]、腫瘤進展[3]、血管新生[4]、淋巴浸潤和轉移[5]相關。這些高表達的BFGF是否由EIF4e所驅動，對于研究非小細胞肺癌血管新生、浸潤和轉移的詳細機制，進而提供新的治療靶點具有重要意義。本研究通過在131例不同分化非小細胞肺癌標本中對HPs、BFGF的表達水平檢測，發現HPs和BFGF蛋白在非小細胞肺癌中表達陽性率顯著高于正常肺組織。高表達的HPs和BFGF與非小細胞肺癌中腫瘤浸潤、淋巴轉移、遠處轉移和較高的臨床分期呈正相關。我們還檢測了HPs與BFGF在非小細胞肺癌中不同區域的表達，分析2者之間的相關性。結果表明，2者之間的相關系數為0.533，提示2者之間密切相關，且成正相關，即HPs的高表達會導致BFGF的表達水平增高。這說明在非小細胞肺癌中，HPs的表達和BFGF具有相似的趨勢，2者可能存在某些調節關系。

在許多腫瘤中，HPs和BFGF的表達具有高度相關性。Yang SX等[10]應用組織芯片分析了多種腫瘤來源的組織，發現HPs和BFGF在黑色素瘤、乳腺癌、結腸癌、非小細胞肺癌、淋巴瘤、前列腺癌和卵巢癌等中都具有相關性[10]。BFGF在非小細胞肺癌中是一個重要的預后因子，而HPs的研究相對較少。Salehi等[11]發現HPs在非小細胞肺癌組織中的表達顯著高于正常肺組織，并且與進展期非小細胞肺癌密切相關。我們的研究證實了這些發現，同時還首次發現非小細胞肺癌中HPs和BFGF的表達具有高度相關性。

HPs和BFGF高度相關，而BFGF能促進血管新生、導致腫瘤微血管密度增加。我們接著比較了HPs表達和MVD的表達趨勢，發現在浸潤深度、淋巴轉移、遠處轉移和臨床分期方面，2者的表達趨勢高度一致。這說明HPs表達能促進血管新生、增加腫瘤微血管密度，這很可能是通過增加BFGF表達介導的。

我們還發現，HPs基因蛋白在高分化、中分化、低分化的表達率是遞增的（66.7%、84.0%、94.1%），提示HPs基因過度表達隨腫瘤惡性程度增加而升高，從而證實HPs有使細胞惡性轉化的能力。而BFGF和MVD在不同分化狀態的非小細胞肺癌標本中的表達無顯著性差異。這表明HPs在不同分化程度非小細胞肺癌的差異表達和腫瘤細胞增殖、致瘤性等特征相關，這可能與促進生長因子的蛋白翻譯有關。我們的研究也證實了其他作者在非小細胞肺癌中的發現：HPs高表達于低分化非小細胞肺癌組織[12]。

我們分析了非小細胞肺癌患者的生存時間，發現HPs表達水平與生存時間顯著相關，HPs表達越高，生存時間越短。多因素分析顯示：HPs的表達程度、遠處轉移及非小細胞肺癌淋巴結轉移是非小細胞肺癌術后影響生存時間的危害性因素。而BFGF和MVD對生存影響相對較小。

我們的研究不僅揭示非小細胞肺癌高表達BFGF和HPs存在相關，還證實HPs是一個比BFGF更好的、用于預測患者生存的預后因子。這將為研究非小細胞肺癌新的治療方法提供重要信息，針對HPs的反義核酸在動物體內可以有效抑制腫瘤生長且毒性很小[13]。因而，非小細胞肺癌中，靶向HPs的治療值得進一步研究。

我們的研究表明：HPs、BFGF協同表達對非小細胞肺癌血管生成、浸潤和轉移起到關鍵性的作用。HPs的過度表達與非小細胞肺癌的致瘤性和生存時間密切相關，且能作為非小細胞肺癌惡性程度的一個分子標志和治療靶標。

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B

1671-1246（2011）08-0091-04

本文系甘肅省科學事業項目“乙酰肝素酶、堿性成纖維細胞因子在肺癌中的表達及臨床意義”（QS061-C33-13）的研究成果