不同添加劑對小麥PPO的抑制和激活效應

司紅起 馮繼明 盧 杰 馬傳喜

不同添加劑對小麥PPO的抑制和激活效應

司紅起 馮繼明 盧 杰 馬傳喜

(農業部安徽省小麥區域技術創新中心安徽小麥產業工程技術研究中心省部共建分子植物育種重點實驗室安徽農業大學農學院，合肥 230036)

通過測定76個小麥品種全麥粉中多酚氧化酶(PPO)在6種化學試劑作用下的酶活性變化情況，比較了這6種化學試劑對PPO的抑制和激活效應，同時分析了添加劑濃度和基因型對抑制激活效應的影響。結果表明:小麥PPO的抑制和激活效應同時受添加劑種類、添加劑濃度和基因型影響;亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C對小麥PPO產生抑制效應，蔗糖和低濃度檸檬酸產生激活效應，而高濃度檸檬酸產生抑制效應，亞硫酸氫鈉的抑制效應比維生素C和谷胱甘肽強;維生素C、谷胱甘肽、銅試劑和亞硫酸氫鈉的添加濃度與PPO活性呈對數關系;谷胱甘肽和維生素C可考慮作為抑制小麥PPO活性的食品添加劑。

小麥 多酚氧化酶 添加劑 抑制劑 褐變 色澤

多酚氧化酶(PolyPhenol Oxidase，PPO)又叫酪氨酸酶、兒茶酚酶、酚酶、氯原酸酶等，因其能結合Cu2+，故又稱金屬蛋白。其主要參與酶促褐變反應而生成有色物質，造成植物經濟價值降低，同時還可能與植物的應激免疫反應有關，如感染病蟲害、早熟、早衰和機械損傷都能誘導多酚氧化酶活性的上升。多酚氧化酶廣泛存在于植物界中。目前對小麥PPO的研究主要集中在 PPO活性檢測［1－3］、PPO與鮮面片和小麥粉色澤的關系［4－7］、PPO 分子標記及其基因克隆定位［8－11］等方面，在小麥 PPO活性控制方面研究相對較少［12－15］。由于PPO活性高是導致小麥粉和面團褐變的主要原因［4－7］，所以對小麥PPO活性進行控制已成為當前研究熱點之一［12－15］。司紅起等［16－17］研究了氯化銅、銅試劑、巰基乙醇、EDTA、飽和NaCl和SDS對小麥PPO活性的影響，指出銅試劑、巰基乙醇和EDTA能較好地抑制小麥PPO活性。本研究以遺傳多樣性極其豐富的微核心種質為試材又分析了檸檬酸、維生素C、蔗糖、亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和銅試劑對小麥PPO的抑制和激活效應，旨在尋求一個能有效控制小麥PPO活性、防止小麥粉和面團褐變、提高小麥粉和食品加工品質的有效方法，進而為今后小麥粉及食品加工、小麥品質育種及尋求無毒害食品添加劑提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1．1 材料和設備

選取76份小麥微核心種質作為供試材料，2006年收獲于安徽農業大學農場內。

UV755B分光光度計:上海精科實業有限公司;3K30冷凍離心機:德國Sigma公司;Cyclotec 1093樣品磨:丹麥FOSS公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 全麥粉的制備

采用帶0．5 mm篩的1093樣品磨對上述76個小麥品種進行磨粉處理。

1．2．2 小麥PPO活性檢測

參考AACC 22－85進行測定。稱取0．300 0 g全麥粉樣品放入約50 mL小燒杯中，加入7．5 mL反應試劑(pH 6．0的磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液，10 mmol/L鄰苯二酚)，恒溫水浴振蕩器上振蕩5 min。振蕩器速度設為100 r/min，溫度設為37℃。迅速將反應后的樣品放在冰塊上終止反應(3 min)。終止反應的樣品迅速混勻，4℃下10 000×g離心5 min。以反應試劑(鄰苯二酚+緩沖液)為對照，在410 nm下測定上清液的吸光度ΔA(ΔA為5 min內吸光值的變化)。PPO活性計算公式為:PPO活性=103×ΔA值/5/0．3(每克全麥粉中 PPO的含量，用410 nm下每分鐘吸光度改變量的1 000倍來表示)，單位為UA410。

1．2．3 添加劑存在條件下小麥PPO活性檢測

稱取0．300 0 g全麥粉樣品放入約50 mL小燒杯中，加入7．5 mL反應試劑(pH 6．0的磷酸氫二鈉－磷酸二氫鈉緩沖液，10 mmol/L鄰苯二酚)，同時加入添加劑(檸檬酸、維生素C、蔗糖、亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和銅試劑，緩沖液配制)至終濃度分別為0．1、0．2、0．4、0．6、0．8 mmol/L，其余操作按1．2．2 程序進行。以反應試劑(鄰苯二酚+緩沖液)+添加劑(終濃度保持一致)為對照，在410 nm下測定上清液的吸光度ΔA(ΔA為5 min內吸光值的變化)。PPO活性計算及單位同 1．2．2。

2 結果與分析

2．1 添加劑對小麥PPO的抑制和激活效應

2．1．1 抑制(激活)倍數與抑制(激活)百分率

抑制(激活)倍數為加入添加劑后，PPO活性凈減少(增加)部分與未加入添加劑PPO活性的比值;最大抑制(激活)倍數指，在同一添加劑濃度下，不同小麥品種中，數值最大的抑制(激活)倍數;平均抑制(激活)倍數指，在同一添加劑濃度下，所有小麥品種PPO活性抑制(激活)倍數的平均值;抑制(激活)百分率指，所有76份小麥品種中，其PPO活性被抑制(激活)的品種數占品種總數的百分比。本研究發現:最大抑制(激活)倍數受基因型的影響較大，而平均抑制(激活)倍數和抑制(激活)百分率受品種數目影響較大。從表1可以看出，亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C對小麥PPO產生抑制效應，蔗糖和低濃度檸檬酸產生激活效應(激活效應不明顯)，而高濃度檸檬酸產生抑制效應(抑制效應不明顯)。亞硫酸氫鈉在0．1～0．8 mmol/L濃度范圍內對所有76個小麥品種PPO均產生了抑制效應，說明亞硫酸氫鈉是一種PPO活性抑制效果較好的添加劑，但要注意添加量。亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和維生素C對PPO的平均抑制倍數隨濃度的增加而增大，說明濃度越高對PPO的抑制效果越好。銅試劑在0．4 mmol/L時對PPO的平均抑制倍數達到最大，隨濃度增加先減小后增大。

表1 抑制、激活倍數及抑制、激活百分率

2．1．2 添加劑對小麥PPO活性的影響

從圖1可以看出:檸檬酸和蔗糖對小麥PPO活性影響較小，前者在0．1～0．4 mmol/L以及后者在0．1～0．8 mmol/L范圍內起激活效應，前者在0．6～0．8 mmol/L范圍內起抑制效應，二者的抑制和激活效應均不明顯。維生素C、亞硫酸氫鈉、谷胱甘肽和銅試劑這四種添加劑對小麥PPO活性影響較大，均起抑制效應，且抑制效應十分明顯。

圖1 6種添加劑對小麥PPO活性的影響

2．2 添加劑濃度對抑制和激活效應的影響

由圖1可知，檸檬酸和蔗糖的添加濃度對抑制、激活效應影響不明顯。由表1可知，添加檸檬酸和蔗糖后，PPO活性在原始活性上下浮動，浮動幅度最大不超過4%。維生素C、谷胱甘肽、銅試劑和亞硫酸氫鈉這四種添加劑隨著添加濃度的增大，PPO活性明顯降低，降低趨勢與添加劑濃度呈對數關系，它們之間的對數關系式分別是:y1= －73．586ln(x1)+213．07，y2=－72．099ln(x2)+212．95，y3= －73．725ln(x3)+218．65，y4= －76．793ln(x4)+198．38，能分別解釋添加劑濃度和PPO活性之間關系的86%，85%，75%，97%，且達極顯著水平，如圖2所示。維生素C和谷胱甘肽這兩種添加劑對小麥PPO活性的抑制效果基本一致，而亞硫酸氫鈉的抑制效果則比前兩者強。銅試劑在0．4 mmol/L時對小麥PPO活性的抑制效果明顯比其他濃度時的抑制效果好。

圖2 添加劑濃度與PPO活性的關系

2．3 基因型對抑制和激活效應的影響

相對活力百分數為添加劑存在條件下的酶活力單位與無抑制劑條件下的酶活力單位之比。相對活力百分數大于1，說明相應的添加劑對PPO起激活效應;相對活力百分數小于1，說明相應的添加劑對PPO起抑制效應。相對活力百分數越大，其對PPO活性抑制效果越差，相反，相對活力百分數越小，其對PPO活性的抑制效果則越好。

以亞硫酸氫鈉為例(圖3)，不同的品種在同一濃度亞硫酸氫鈉作用下，其相對活力百分數也不同，相對活力百分數變化較大，說明基因型對抑制效應影響明顯，其原因可能是PPO種類不同，控制合成PPO的基因不同，即存在一個質的問題;同一品種在不同濃度亞硫酸氫鈉作用下，其相對活力百分數也不同，多數品種相對活力百分數變化較大，少數品種相對活力百分數變化較小，可能是因為品種不同，其所含PPO的量也不同，即存在一個量的問題。同一品種在不同添加劑作用下，其相對活力百分數不同;不同品種在相同添加劑作用下，其相對活力百分數也不同;檸檬酸和蔗糖作用下的76個品種的PPO相對活力百分數在1．0上下浮動，而維生素C、谷胱甘肽和亞硫酸氫鈉作用下的76個品種的PPO相對活力百分數在0．5上下浮動(圖4)。圖3、圖4說明抑制和激活效應均受基因型的影響，影響程度因基因型而異。

3 結論

小麥粉中PPO是引起面制食品產生褐變的重要因素之一，通過添加劑來控制PPO活性是方便、快捷而又十分有效的方法。

3．1 亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C對小麥PPO產生抑制效應，蔗糖和低濃度檸檬酸產生激活效應(激活效應不明顯)，而高濃度檸檬酸產生抑制效應(抑制效應不明顯)。維生素C和谷胱甘肽這兩種添加劑對小麥PPO活性的抑制效果基本一致，而亞硫酸氫鈉的抑制效果則比前兩者強。

3．2 維生素C、谷胱甘肽、銅試劑和亞硫酸氫鈉的添加濃度與PPO活性呈對數關系，其對數關系式分別為:y1= － 73．586ln(x1)+213．07，y2= － 72．099 ln(x2)+212．95，y3= －73．725ln(x3)+218．65，y4=－76．793ln(x4)+198．38，能分別解釋添加劑濃度和PPO活性之間關系的86%，85%，75%，97%，且達極顯著水平。

3．3 亞硫酸氫鈉、銅試劑、谷胱甘肽和維生素C是較理想的小麥PPO活性抑制劑，而谷胱甘肽和維生素C可

考慮作為抑制小麥PPO活性的“綠色”“食品添加劑。3．4 小麥PPO的抑制和激活效應同時受添加劑種類、添加劑濃度和基因型影響。

［1］楊朝柱，馬傳喜，司紅起，等．普通小麥品種多酚氧化酶活性的變異［J］．中國農業科學，2004，37(11):1713－1717

［2］陸成彬，程順和，張伯橋，等．基因型和地點對小麥品種面粉多酚氧化酶活性的影響研究［J］．中國農業科學，2005，38(1):13－16

［3］司紅起，馬傳喜，何克勤，等．小麥多酚氧化酶活性檢測方法的比較分析［J］．糧食與飼料工業，2007(7):8－10

［4］胡瑞波，田紀春．鮮切面條色澤影響因素的研究［J］．中國糧油學報，2004，19(6):18 －22

［5］華為，馬傳喜，何中虎，等．小麥鮮面片色澤的影響因素研究［J］．麥類作物學報，2007，27(5):816 －819

［6］葛秀秀，何中虎，楊金，等．我國冬小麥品種多酚氧化酶活性的遺傳變異及其與品質性狀的相關分析［J］．作物學報，2003，29(4):481 －485

［7］蘭靜，王樂凱，張守文，等．影響面粉色澤因素的研究［J］．麥類作物學報，2004，24(4):75 －79

［8］Sun D J，He Z H，Xia X C，et al．A novel STS marker for polyphenol oxidase activity in bread wheat［J］．Molecular Breeding，2005，16:209 －218

［9］He X Y，He Z H，Zhang L P，et al．Allelic variation of polyphenol oxidase(PPO)genes located on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat［J］．Theor Appl Genet，2007，115:47 － 58

［10］He X Y，He ZH，Morris CF，et al．Cloning and phylogenetic analysis of polyphenol oxidase genes in common wheat and related species［J］．Genet Resour Crop Evol，2009，56:311 －321

［11］Wang X B，Ma C H，Si H Q，et al．Gene markers for grain polyphenol oxidase activity in common wheat［J］．Mol Breeding，2009，23:163 －170

［12］張曉，田紀春，胡瑞波．SDS對小麥多酚氧化酶提取效率及激活效應影響的研究［J］．中國糧油學報，2008，23(1):26－31

［13］司紅起，馬傳喜，余亮．檸檬酸對小麥多酚氧化酶活性的影響［J］．糧食與飼料工業，2008(10):7－8

［14］黃海霞，張真，吳金芝．小麥多酚氧化酶特性及褐變控制研究［J］．安徽農業科學，2008，36(31):13574 －13575，13638

［15］常成，張海萍，尤明山，等．抗壞血酸對小麥多酚氧化酶活性抑制的研究［J］．中國糧油學報，2007，22(1):14 －18

［16］司紅起，馬傳喜，夏云祥，等．酶活抑制劑對小麥PPO活性的影響［J］．中國糧油學報，2006，21(4):35－39

［17］司紅起，馬傳喜，董召榮，等．小麥多酚氧化酶抑制和激活效應的研究［J］．中國農學通報，2006，22(2):195 －198．

Inhibition and Activation Effects of Different Additives on Wheat PPO Activity

Si Hongqi Feng Jiming Lu Jie Ma Chuanxi
(Anhui Provincial Wheat Area Tech－nology Innovation Centre of Ministry of Agriculture Wheat Industry Engineering Tech－nology Research Centre of Anhui Province Key Laboratory of Plant Molecular Breeding of Ministry of Education School of Agronomy of Anhui Agricultural University，Hefei 230036)

Seventy － six wheat cultivars were selected as the experimental materials，and polyphenol oxidase(PPO)was extracted by citric acid － phosphate buffer from their whole wheat flour．Six chemical reagents selected as PPOinhibitors and activators were put into the enzymical extract，and then PPO activity was determined using spectrophotometer．The results showed that:the inhibition and activation were influenced by kinds，concentration of additives and wheat cultivars;sodium hydrogen sulfite，sodium diethyldithiocarbamate，glutathione and vitamin C had the inhibition on wheat PPO，and the sucrose and lower concentration citric acid had unobvious activation．However，higher concentration citric acid had unobvious inhibition and the inhibition of sodium hydrogen sulfite was stronger than vitamin C and glutathione;it was presented for logarithmic relationship between wheat PPO activities and concentrations of vitamin C，glutathione，sodium diethyldithiocarbamate and sodium hydrogen sulfite;Glutathione and vitamin C could be used as the food additives to inhibit wheat PPO activity．

wheat，polyphenol oxidase，additive，inhibitor，browning，color

S512．1

A

1003－0174(2011)07－0006－04

國家科技支撐計劃(2009BADA6B01)，現代農業產業技術體系專項經費，安徽省良種優質化專項(08010 301065)，安徽農業大學科研啟動基金(wd2008－10)

2010－08－18

司紅起，男，1972年出生，副教授，小麥品質改良及分子育種

馬傳喜，男，1963年出生，教授，小麥品質改良及分子育種