新疆疆岳驢乳粉增強小鼠免疫功能的研究

王紅娟，鄭崢，楊潔

（新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046）

新疆疆岳驢乳粉增強小鼠免疫功能的研究

王紅娟，鄭崢，楊潔

（新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046）

探討驢乳凍干粉對環磷酰胺所致小鼠免疫功能低下的影響。環磷酰胺誘導小鼠免疫功能低下，給小鼠飼喂不同劑量的驢乳凍干粉，并于30 d后測定免疫指標。結果表明：飼喂驢乳粉后，小鼠的T淋巴細胞陽性率由免疫低下組的23.89%上升至驢乳高劑量組的55.70%；白細胞數量由免疫低下組的4.36上升至高劑量組的9.21；吞噬率由免疫低下組的20.9%提高到高劑量組37.2%，吞噬指數由免疫低下組的0.31提高到驢乳高劑量組的0.62；小鼠胸腺指數由免疫低下組的0.012上升到高劑量組的0.02；CD4+/CD8+比例由免疫低下組的0.82提高到高劑量組的1.81,血清IgG質量濃度由免疫低下組的0.453 g/L提高到高劑量組的0.727 g/L。驢乳不僅能提高機體的免疫能力，而且對環磷酰胺所造成的免疫低下具有緩解作用。

驢乳粉;環磷酰胺;免疫低下小鼠;免疫調節

0 引言

驢乳蛋白質中富含人體必需氨基酸，同時含有豐富的兒童生長所必需的組氨酸[1]。大量臨床病例證實，約有3%三歲前的嬰幼兒會出現由IgE介導的牛乳過敏癥，驢乳可以作為牛乳過敏嬰幼兒的替乳食品[2]。同時驢乳可以治療多種疾病，如預防動脈粥樣硬化，增強血管神經擴張和作為有效地抗菌劑[3]，尤其對豬霍亂沙門氏菌和志賀痢疾桿菌的抗菌活性最為敏感[4,5]。此外，驢乳具有低脂肪、低膽固醇的特點[6]。

目前，國內外相繼對牛乳抗炎性、降血脂、提高免疫力作用進行了報道，但對驢乳影響動物機體免疫力的研究尚未見報道。因此本文通過研究不同質量濃度驢乳凍干粉溶液對環磷酰胺所致免疫低下模型小鼠的影響，為研究驢乳的生理活性提供重要的基礎資料。

1 實驗

1.1 材料

受試物：驢乳凍干粉，采自新疆岳普湖的新鮮疆岳驢乳樣品，冷凍干燥后備用。

動物：昆明種小鼠，體質量為18～22 g，雌雄各半。

主要試劑：注射用環磷酰胺，飼料為全價顆粒狀飼料，貞芪扶正膠囊，羊抗小鼠IgG，HRP酶標羊抗小鼠IgG，鄰苯二胺（OPD）。

儀器：AG204型分析天平，真空冷凍干燥機，酶標儀，流式細胞儀。

1.2 方法

小鼠稱重后隨機分為6組：正常組，免疫低下組，陽性對照組，驢乳粉低0.75 g（每千克體質量)，中1.50 g（每千克體質量)，高3.00 g（每千克體質量)三個劑量組，每組10只。其中免疫低下組，陽性對照組，驢乳粉低、中、高3個劑量組在第1，5，10，15，20，25天，同時皮下注射環磷酸胺40 mg/kg，建立小鼠免疫低下模型。正常組和免疫低下組每日生理鹽水灌胃，陽性對照組灌胃貞芪扶正膠囊4.20 g（每千克體質量)，3個劑量組分別用不同質量分數的驢乳粉給小鼠灌胃，共30 d。第31天測定小鼠免疫指標。

1.3 免疫指標檢測

1.3.1 T淋巴細胞陽性率的測定

按照朱辛為等α-醋酸萘酯酶（ANAE）方法[7]，用體積分數為75%酒精將小鼠尾端局部消毒，待酒精干燥后用剪刀在尾端部約0.2 mm處剪掉，待血液自行流出后用玻片取血，推片，置于甲醛-丙酮固定液中固定，干燥，進行ANAE染色。鏡檢100個淋巴細胞求得ANAE陽性百分率。

1.3.2 白細胞計數

小鼠眼球取血20 μL，加入0.38 mL白細胞稀釋液中混勻，取混勻稀釋血液1滴，滴入計數盤中，靜置2～3min，用低倍鏡計數四角的四大格中的白細胞總數。

1.3.3 巨噬細胞吞噬能力的測定

小鼠腹腔注射1 mL 2%雞紅細胞，脫臼處死，吸取腹腔液，滴一滴于玻片上，展開液滴，自然干燥，瑞士-姬姆薩染液染色。油鏡觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞的情況。吞噬指數=100個巨噬細胞吞噬的雞紅細胞總數/100；吞噬百分數=100個巨噬細胞中吞噬了雞紅細胞的細胞數/100。

臟器指數（mg/g）=（臟器重量/小鼠體質量）×10。

1.3.4 T淋巴細胞CD4+/CD8+比例的測定

按照陶冬青,陳如泉等測定CD4+/CD8+比例的方法[8-9]，每組取5只小鼠，眼眶采血0.5mL,加入5 μL肝素鈉抗凝。取50 μL肝素鈉抗凝全血，加入小鼠CD4-PE單抗、CD8-FITC單抗各10 μL，混勻，室溫反應15 min。加入950 μL紅細胞裂解液?；靹?，室溫反應15 min。1000 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 500 μL洗兩次。PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。

1.3.5 血清中免疫球蛋白IgG的測定

按照靳艷等用間接ELISA法測定IgG的方法[10-11]，特異羊抗小鼠IgG作為一抗包被酶標板，HRP酶標羊抗小鼠IgG作為檢測抗體，鄰苯二胺（OPD）為底物，測定小鼠血清樣品相應的OD490；以標準IgG作標準曲線，計算各組小鼠血清IgG質量濃度。

1.3.6 脾臟細胞形態觀察

取脾臟制作石蠟切片，觀察細胞形態變化。

1.4 數據處理

所有數據使用SPSS 13.0軟件進行分析。采用方差分析ANOVA，結果以x±s表示，各項指標的描述性數據均用“均值±標準誤”表示，顯著性水平取ɑ=0.05。

2 結果

2.1 免疫低下小鼠觀察

免疫低下組灌胃生理鹽水后小鼠形體消瘦，運動遲緩，反應遲鈍，體重明顯下降。陽性對照組與驢乳灌胃組精神狀況良好，行動靈活，且隨著驢乳劑量的增加，精神狀況更佳，呈劑量依賴性。

2.2 對免疫低下小鼠T淋巴細胞和白細胞的影響

表1為驢乳粉對小鼠T淋巴細胞和白細胞的影響。由表1可以看出，與正常組相比，環磷腺胺所致的免疫低下組T淋巴細胞陽性率、白細胞數明顯下降，且差異顯著（P＜0.05），說明造模成功。與免疫低下組相比，灌胃驢乳各組T淋巴細胞陽性率和白細胞數明顯升高，高劑量組T淋巴細胞陽性率和白細胞數幾乎達到陽性對照組水平。

表1 對小鼠T淋巴細胞和白細胞的影響

T淋巴細胞介導細胞免疫應答，并在機體針對TD抗原的體液免疫應答中發揮重要輔助作用。灌胃驢乳后，T淋巴細胞陽性率明顯上升，說明驢乳可刺激T淋巴細胞數量增長,對提高機體免疫功能有促進作用。白細胞能吞噬異物產生抗體，在機體損傷治愈、抗御病原入侵和對疾病免疫方面起重要的作用。機體發生炎癥或其他疾病都可引起白細胞總數及各種白細胞百分比發生變化，因此白細胞總數成為檢測免疫作用的重要標準之一。驢乳對環磷腺胺所致的免疫低下小鼠WBC下降有保護作用，可增強機體的免疫力。

2.3 對免疫低下小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

表2為驢乳粉對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響。如表2所示，與正常組相比免疫低下組的吞噬指數和吞噬率明顯下降，差異顯著（P＜0.05）。與免疫低下組相比，各劑量驢乳組巨噬細胞和吞噬雞紅細胞的吞噬指數和吞噬率均有提高。3個劑量組與免疫低下組之間差異顯著（P＜0.05），其中高劑量組作用最強，與陽性對照組無顯著差異（P＞0.05）。

巨噬細胞有很強的吞噬能力，主要吞噬外來顆粒如微生物、大分子（包括抗原分子）甚至損傷或死亡的自身組織。此外，巨噬細胞將攝取和處理后的抗原提呈于細胞表面，供抗原特異性T淋巴細胞識別，參與特異性免疫反應。上述實驗結果表明灌胃驢乳能顯著地提高小鼠巨噬細胞活性。

表2 對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響

2.4 對免疫低下小鼠T淋巴細胞CD4+/CD8+和IgG的影響

CD4+淋巴細胞亞群以Th細胞為主，CD8+淋巴細胞亞群以Ts細胞為主,CD4+淋巴細胞能增強和擴大機體的免疫應答,CD8+淋巴細胞能抑制免疫應答過程，兩種作用相反的T淋巴細胞借助相互拮抗,調節機體免疫應答。CD4+/CD8+的比值反映機體免疫內環境是否穩定，兩者平衡決定了免疫反應的總效應，若比值偏離正常值，說明機體免疫功能失調。與正常組相比，免疫低下組的CD4+/CD8+比例下降，且差異顯著（P＜0.05），說明造模成功。3個不同質量濃度驢乳粉劑量組的CD4+/CD8+比例均呈上升趨勢，中低劑量組與免疫低下組差異不顯著（P＞0.05），其中高劑量組與免疫低下組差異顯著（P＜0.05）（表3）。結果說明灌胃驢乳可有效地改善CD4+／CD8+比值的降低，且有一定的劑量依賴性。

表3 對小鼠T淋巴細胞CD4+/CD8+和IgG的影響

IgG是血清和細胞外液中主要的抗體成分，對多種細菌和病毒有抑制和中和作用。與正常組相比，免疫低下組IgG質量濃度顯著降低。3個劑量組血清中IgG的質量濃度較免疫低下組增高，且差異顯著（P＜0.05），且高劑量組與陽性對照組無顯著性差異（P＞0.05）。結果說明驢乳能改善環磷胺造成的免疫低下，可提高免疫低下小鼠血液中IgG水平。

2.5 對免疫低下小鼠臟器指數的影響

通過驢乳凍干粉對免疫低下的小鼠臟器指數統計，結果如表4所示。由表4可以看出，免疫低下小鼠的胸腺指數下降，與正常組相比差異顯著（P＜0.05）。各灌胃驢乳組與正常組相比，中劑量和高劑量組已達正常組水平。各灌胃驢乳組的肝指數也上升，但各組差異不顯著（P＞0.05）。胸腺是機體細胞免疫的中樞器官，對外周免疫器官的發育起主導作用，其功能狀態直接決定機體細胞免疫功能，并間接影響體液免疫功能。實驗結果說明環磷腺胺導致小鼠免疫器官胸腺萎縮，而驢乳粉對小鼠免疫器官胸腺有明顯的保護作用。

表4 驢乳粉對小鼠臟器指數的影響

2.6 脾臟細胞形態觀察

通過石蠟切片對不同處理組的脾臟細胞進行觀察，結果如圖1所示。由圖1可以看出，正常組的脾臟細胞形態特征為細胞多為橢圓形，排列密集，邊界清晰，形態完整，胞質豐富致密，著色深（圖1（a））；免疫低下組的脾臟細胞數量明顯減少，大部分細胞縮小，細胞邊緣不整齊，胞質大量減少，空虛部分較多，著色較淺（圖1（b））；隨著驢乳質量濃度劑量的增高，脾臟細胞逐漸規則完整，驢乳高劑量組脾臟細胞多為橢圓形，細胞排列密集，大小較一致，邊界清晰，形態完整，胞質豐富，較致密，著色深（圖1（e））。這種變化可能是由于細胞活動功能降低、血液和營養物質供應不足，以及神經內分泌刺激減少引起器官的實質細胞體積或數目的減少所致。只要原因消除，已萎縮的細胞、組織可回復原狀。結果說明驢乳能夠緩解環磷酰胺導致的脾臟萎縮，對免疫器官有一定的修復作用。

3 結果與討論

驢乳中富含溶菌酶、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白，主要成分與人乳非常相似[12]。Criscione等[13]研究發現驢乳中的蛋白具有多態性，采自不同地方的驢乳樣，通過測定成分發現，有的驢乳中缺乏αs1酪蛋白，有的缺乏β-乳球蛋白II。Cunsolo等[14]對驢乳的蛋白質組進行了研究，結果發現驢乳中10%的蛋白組分可以通過已有的數據庫進行鑒定，70%的蛋白組分只能通過與驢同源的馬屬的蛋白數據庫進行鑒定，另有20%蛋白組分尚未鑒定。因此有必要對驢乳的生理功能與生物活性成分進行進一步研究。

為了探討驢乳對小鼠免疫力的影響作用，本研究以新疆岳普湖縣的疆岳驢驢乳為研究對象，以不同質量濃度的驢乳凍干粉溶液飼喂環磷酸胺致免疫低下小鼠，分別統計觀察不同處理組小鼠的形態、T淋巴細胞和白細胞數量、巨噬細胞吞噬功能、對T淋巴細胞CD4+/CD8+和IgG的影響以及用顯微石蠟切片技術觀察了不同處理組脾臟細胞形態，結果表明，驢乳能夠有效地提高免疫低下小鼠的免疫力。通過灌胃驢乳溶液，能夠改善環磷酰胺造成的CD4+/CD8+比例失調，對被環磷酰胺破壞的免疫器官起到一定的修復作用，可提高機體T淋巴細胞和白細胞數量以及提高腹腔巨噬細胞吞噬指數和吞噬率，能增高血清中IgG質量濃度，部分免疫指標可基本達到正常水平。隨著驢乳質量濃度增加，小鼠免疫力增強，這暗示了驢乳對提高免疫功能具有劑量依賴性。新疆是我國養驢最多的省(區)[15]，大力發展驢乳業不僅可以很好的促進我國新型乳制品的開發、推動我國乳品工業發展，也可以因地制宜，充分挖掘新疆驢乳產業優勢。本實驗為新疆驢乳的綜合開發利用提供了科學依據。

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Immune function influence of Xinjiang Jiangyue Donkey Milk Powder on immunodepressed mice

WANG Hong-juan,ZHENG Zheng,YANG Jie
(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

To observe the donkey milk powder on immunodepression induced by cyclophosphamide in mice.The immunodepression was induced by cyclopho*sphamide,the different dose of donkey milk powder were given to mice for 30 days and measure parameters.The masculine ratio of T lymphocytes increased from 23.89%of immundepressed group to 55.70%of high-dose donky milk group；WBC number increased from 4.36 of immundepressed group to 9.21 of high-dose donky milk group；Phagocytosis rate increased from 20.9%of the immundepressed group to 37.2%，Phagocytic index increased from 0.31 of immundepressed group to 0.62 of high-dose group of donky milk, increased by nearly two times；Thymus index increased from 0.012 of immundepressed group to 0.02 of high-dose donky milk group;CD4+/CD8+rate increased from 0.62 of immundepressed group to 1.81 of high-dose group of donky milk,IgG increased from 0.453 of the immundepressed group to 0.727.Donkey milk powder can improve the immunity，and alleviate immunodepression caused by cyclophosphamide in mice.

donkey milk powder;cyclophosphamide;immunodepressed mice;immune function modulate

Q936

A

1001-2230（2012）05-0020-04

2011-12-12

新疆維吾爾自治區自然科學基金(No.2010211A04),自治區科技支疆項目計劃項目(No.201191255)。

王紅娟(1986-)，女,碩士研究生，從事生化制藥與食品生物學研究。

楊潔