半滑舌鰨三倍體誘導研究＊

劉志鵬，王旭波，翟介明，張全啟＊＊

（1.中國海洋大學海洋生命學院，山東青島266003；2.萊州明波水產有限公司，山東煙臺261400）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）隸屬于鰈形目（Pleuronectiformes）、舌鰨科（Cynoglossidae）、舌鰨屬（Cynoglossus），俗稱為鰨米、龍利等，為近海溫水性大型底棲魚類，主要在黃海、渤海區域。半滑舌鰨是一種名貴的海水魚類，由于其肉鮮味美、營養豐富，深受廣大消費者歡迎，擁有很高的經濟價值和廣闊的養殖前景［1］。隨著近些年來我國北方興起的比目魚養殖熱潮，半滑舌鰨已經成為我國海水魚類養殖的主要品種之一。優良品種是養殖產業的基礎，但目前對半滑舌鰨的養殖品種缺乏有效地選育，在養殖中的情況并不令人滿意，因此改良現有種質資源，提高品種的繁殖、發育水平，進而培育出產量高、抗病強的新品種就成為了推動半滑舌鰨養殖產業發展的關鍵。

魚類多倍體育種是魚類遺傳育種工作的重點研究領域之一，三倍體魚類一般具有不育或低育性［2］，可以在成魚期將二倍體消耗在生殖腺發育的能量用于生長，克服性成熟帶來的不利影響，減少由于過早成熟造成的產量和質量下降，因而能提高肉類質量和餌料轉換效率［3－4］，可被應用于大規格商品魚培育，例如在加拿大，大規模的三倍體苗種養殖幾乎遍布全國，他們用三倍體苗種抑制魚類性成熟造成的死亡以及肉質下降［5］，因此三倍體育種受到國內外水產科學工作者的廣泛重視。本研究對半滑舌鰨三倍體的培育進行了嘗試，使用冷休克法誘導得到了半滑舌鰨的三倍體，并篩選了最佳的誘導條件，為進一步開展半滑舌鰨細胞工程育種提供了基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚

實驗所用魚取自萊州明波水產有限公司人工養殖的半滑舌鰨適齡親魚，選取性腺已經開始發育的健康親魚，雌魚體重1.5～2.5 kg，雄魚體重150～300 g，在循環水養殖車間養殖，控光控溫進行催熟，性腺成熟后用GNRH組合催產劑進行催產。

1.2 人工授精

選取性成熟的雌雄魚，通過擠壓腹部的方法來采集卵子和精液。收集完畢后將精卵混合均勻，加入海水攪拌授精，并記錄受精時間。

1.3 冷休克處理溫度的確定

根據半滑舌鰨雌核發育［6］以及預實驗得到的初步數據，設置2、3、4、5、6、7℃6個溫度梯度，在受精后4～5 min，將盛有受精卵的篩網放入各梯度海水中進行冷休克處理，持續時間為20～25 min。每組處理完畢后各取1 000粒受精卵放入單獨的篩網中在23℃的海水里進行孵化，另取1 000粒未處理的受精卵作為對照組。及時統計各組的死卵，統計孵化率并在仔魚孵出后統計三倍體率。實驗重復3次。

1.4 倍性檢測

參考楊景峰的方法并做稍許改進，在仔魚孵化2 d后，取30尾分別加一步法試劑，粉碎魚體解離細胞，用200目的篩絹過濾細胞后，用流式細胞儀進行分析，二倍體對照組初孵仔魚的DNA相對含量設為100［7］。

1.5 最佳起始時間和持續時間的篩選

在確定最佳冷休克處理溫度后，將起始時間分為受精后3、4、5、6、7 min 5個梯度，在最佳水溫下每個梯度持續處理15、20、25、30、35 min。統計孵化率并在仔魚孵出后統計三倍體率。

1.6 染色體鑒定

在魚苗發育至體長10～15 cm左右的時候，參考周麗清的方法進行染色體制片并做稍許改進［8］。從魚鰓蓋下沿的腹腔部注射PHA溶液（用0.7%的NaCl配制，終濃度為5 mg／m L）處理3 h，然后在同一位置注射秋水仙素溶液（用0.7%的NaCl配制，終濃度為1 mg／m L）處理1 h，將魚放血取出頭腎，在生理鹽水中進行解離并過濾到離心管中，1 000 r／min離心8 min并洗滌細胞，接著在濃度為0.075 mol／L的KCl中低滲處理30 min后再離心8 min收集細胞，最后用新配制的預冷卡諾固定液（無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）固定3次，每次不少于30 min。滴片時采用冷滴片法，用10%的Giemsa染色30 min，顯微鏡下觀察中期分裂相并拍照，觀察50尾個體。

2 結果

2.1 最佳冷休克溫度

在受精后4～5 min，處理20～25 min的相同條件下，6個不同的冷休克處理溫度與半滑舌鰨平均三倍體率的關系如圖1所示，在3～6℃的溫度下都有三倍體仔魚孵化，其中4～5℃時三倍體率最高，在此將4℃確定為最佳處理溫度，此時三倍體率最高為27.8%，孵化率為5.3%。

圖1 不同冷休克溫度與半滑舌鰨三倍體誘導率的關系Fig.1 The relationship between the yield of triploid and the temperature of cold shocks in C.semilaevis

2.2 最佳起始時間和處理時間

在根據上述實驗得到的最佳處理溫度4℃下，起始時間和持續時間與平均三倍體率（3n）、平均孵化率（H）的關系如表1所示。各處理組的孵化率均不高，在起始時間相同的情況下，處理時間越長，孵化率越低，受精后3和35 min處理時間的實驗組孵化率為0，而在相同的處理時間下，孵化率與起始時間沒有特別明顯的關系。各處理組的三倍體率也是非常低，其中以受精后5 min為處理起始時間，20 min為持續處理時間獲得的三倍體率最高，雖然在此條件下受精卵的孵化率不是最高的，但考慮到本研究中孵化率都比較低，因此最佳起始時間為受精后5 min，最佳處理時間為20 min。

表1 不同處理起始時間和持續時間對半滑舌鰨三倍體誘導效果Table 1 The triploidy induction result of different starting time and shock duration

2.3 染色體鑒定

染色體觀察結果（見圖2，圖中箭頭所示為W染色體，標尺為5μm）表明，未經處理的正常二倍體染色體核型為2n＝42，為ZZ（見圖2A）和ZW（見圖2B），經過冷休克處理的三倍體染色體核型為3n＝63，其性染色體有2種類型，分別為ZZZ（見圖2C）和ZWW（見圖2D），證明了它們確實是半滑舌鰨的三倍體。

3 討論

3.1 誘導方法

人工誘導魚類三倍體常用的有生物、物理、和化學3種方法，冷休克是一種物理方法，因為其操作簡便，處理量大目前被廣泛應用。用冷休克誘導三倍體需要確定3個重要因素：處理開始時間、處理水溫以及持續時間，實驗也表明半滑舌鰨三倍體誘導明顯受到這3個因素的影響。

魚類三倍體誘導的原理是抑制受精卵第二極體出，在受精卵中多保留一套母本染色體而成為三倍體，所以冷休克起始時間必須在第二極體排出之前。有的研究把卵從第二次成熟分裂中期到第二極體排出的這段時間劃分為啟動期、敏感期和不應期3個階段［9］，在敏感期內適當的處理就能將第二極體保留在受精卵內，當從敏感期進入不應期后外界處理對抑制第二極體排出失去作用，無法產生三倍體。在本研究中，半滑舌鰨受精卵在受精后5 min誘導的效果最好，說明受精卵正處于敏感期，是抑制第二極體排出的最佳時期，而起始時間在受精7 min以后的三倍體率非常低，受精卵已經進入了不應期。大部分魚類的三倍體誘導起始時間為3～10 min［10］，與本研究結果相符。第二極體的排出時間也與受精水溫、卵子成熟程度等有很大關系，因此在確定處理起始時間時還應考這些方面的影響。

冷休克處理溫度不應過低或過高，最合適的溫度應該是其亞致死溫度［11］，過低的溫度會超過受精卵承受的極限，使受精卵大量甚至全部死亡，而過高的溫度又起不到誘導的效果。在本研究中，當處理溫度低于4℃時，胚胎大量死亡，三倍體率也明顯下降，而5和6℃進行冷休克的三倍體率也比使用4℃進行處理的三倍體率低，說明在亞致死溫度以內，溫度越低對第二極體釋放的抑制作用越強。

在起始時間和處理溫度都確定的情況下，處理時間會直接影響受精卵的誘導率和孵化率，本研究中處理20 min時誘導率最高，但隨著處理時間的延長，誘導率和孵化率都開始下降，直到受精卵全部死亡，過長的處理時間會對受精卵造成嚴重損傷。需要注意的是，同一種魚不同的人用相同的方法進行多倍體誘導也會出現不同的結果，這可能與試驗用魚的地理種群、養殖工藝、性腺成熟度、倍性鑒定方法等因素有關。

3.2 誘導率和孵化率

在本實驗中，三倍體率與孵化率之間沒有明顯的相關性，例如在處理溫度較高的6和7℃中或是10 min等處理強度較低的實驗組中，低強度冷處理對受精卵的發育和分化影響較小，受精卵的孵化率比較高，但在這些實驗組中的三倍體率卻很低甚至為0，而在最佳處理條件下進行處理時其誘導率雖然是最高的，但其孵化率卻不是最高的。

本研究驗證了冷休克對半滑舌鰨三倍體的誘導是有效的，在初孵仔魚期的最高三倍體率達到35%，但與在黑鯛（50%）［12］、大菱鲆（70%）［13］等冷休克誘導的三倍體率相比，半滑舌鰨的誘導率還是比較低。未經處理的對照組受精卵孵化率在50%左右，而在經過篩選的最佳處理條件下（受精后5 min，4℃下處理20 min）冷休克后的孵化率只有5.5%，經觀察，發現在冷休克處理后，胚胎受到了較大程度的損傷，到原腸期階段就無法繼續發育，導致孵化率非常低。與興國紅鯉（50%～70%）［14］、紅鰭東方鲀（80%）［15］等進行冷休克誘導三倍體的孵化率相比，半滑舌鰨的孵化率明顯偏低，這可能是因為半滑舌鰨的受精卵對低溫損傷更為敏感，所以造成了其孵化率大大低于別的魚類。

3.3 三倍體半滑舌鰨的性染色體類型

半滑舌鰨的雌性個體中被發現含有1條巨大的異形染色體，經推測為W性染色體，進而推測半滑舌鰨的性別決定類型是ZZ／ZW型，雌性為配子異型ZW，雄性為配子同型ZZ［8，16］。由此可以推測出通過抑制受精卵第二極體釋放而形成的三倍體，其染色體類型應該為ZZZ和ZWW。本研究中進行的半滑舌鰨三倍體個體的染色體制片，經過鏡檢后確實發現了這2種類型的染色體，且其比例為1∶1，未發現ZZW型的三倍體個體。這一結果說明在半滑舌鰨雌魚減數分裂中，Z染色體和W染色體之間的交叉互換被嚴重抑制，半滑舌鰨雌雄個體之間巨大的形態差異，除了與W染色體“多余”的遺傳信息相關外，可能與ZW染色體之間的遺傳信息交流受阻有關，而這種交換的機制也恰好是性染色體起源與進化的必然途徑。

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