糖酵解與肺癌相關研究進展

劉博寧 羅猛 綜述 周清華 徐克 審校

肺癌是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤。男性中肺癌占新發腫瘤病例的17%以上，約占癌癥死亡總數的23%，且發病率呈上升趨勢[1]。肺癌患者中約80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）。NSCLC預后較差，主要與局部復發及遠處轉移有關，而較多患者就診時已經發生局部侵潤（37%）和遠處轉移（38%）[2]。在NSCLC等實體腫瘤的生長過程中，癌細胞增殖迅速造成癌組織微環境始終處于相對低氧狀態。此現象在實體腫瘤中普遍發生，是腫瘤微環境最重要的特征之一，其主要機制與腫瘤生長不一致造成腫瘤血管結構功能的異常有關。低氧可導致腫瘤細胞的基因及蛋白質表達發生改變，致使腫瘤生長受限，發生細胞周期停滯、凋亡和壞死；同時，低氧也可通過誘導新生血管、加強糖酵解、激活生長因子而抑制凋亡[3]。近期研究表明，低氧下糖酵解的增強與NSCLC等實體腫瘤的發展、侵襲和轉移密切相關。本文就有氧糖酵解中的重要調控因子缺氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）和葡萄糖轉運體（glucose transporter, GLUT）與肺癌的相關性進行綜述，為肺癌防治提供新的思路和理論基礎。

1 瓦博格效應與腫瘤

細胞的能量獲取主要源于糖代謝。葡萄糖在體內氧化分解的途徑包括氧化磷酸化和糖酵解。正常細胞在有氧條件下主要通過氧化磷酸化產生ATP，而在缺氧條件下則主要通過糖酵解產生ATP。1924年首次提出瓦博格效應（warburg effect），指出細胞在癌變時主要通過糖酵解獲取ATP，即在氧充足的條件下其能量代謝的主要途徑由三羧酸循環切換為有氧糖酵解[4]。有氧糖酵解是腫瘤惡變過程中最基礎的代謝改變，此現象廣泛存在于各種腫瘤組織中，它能夠促進腫瘤細胞的增殖、增強侵襲性并參與介導耐藥[4-6]。

大量研究[7,8]證實瓦博格效應的產生及惡性細胞對其依賴程度由細胞內部和外部環境共同決定，并由多基因（如癌基因RAS、C-MYC、AKT、BCR/ABL和抑癌基因p53等）及信號激酶（如AMP激酶、AKT激酶等）共同調控。其中許多癌基因和抑癌基因自發性改變參與此能量代謝調控過程[9,10]。此外，參與有氧糖酵解調控的關鍵因子還有HIF-1、GLUT1和GLUT3、乳酸、糖酵解酶類、碳酸酐酶等，其中尤以HIF-1和GLUT1的過度表達與NSCLC的增殖和轉移密切相關[11-14]。

2 HIF-1與NSCLC

2.1 HIF-1活性的調節 缺氧可分為急性缺氧（灌注限制性缺氧）和慢性缺氧（彌散限制性缺氧）[15]，可引發腫瘤細胞基因及蛋白質表達發生改變，誘導血管新生、加強糖酵解、激活生長因子、抑制凋亡，使腫瘤細胞克服并適應低氧和營養缺乏的微環境。HIF-1是一種介導低氧適應性反應的轉錄因子，可激活許多低氧反應性基因的表達，是在低氧條件下維持氧穩態的關鍵性物質。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位構成，HIF-1α為主要的氧調節亞基，低氧主要通過調節其蛋白水平來影響HIF-1的轉錄調節作用；HIF-1β則對氧的依賴性較弱，其堿基可以特異性識別靶基因上DNA的結合位點，發揮轉錄因子的激活特性。HIF-1作為缺氧相對特異性的內源性標記物和缺氧誘導過程中最重要的轉錄因子，其表達程度可代表腫瘤瞬時缺氧的狀況。

近期研究表明，在多種人類腫瘤中癌基因可不依賴缺氧誘導，直接活化HIF-1和其它葡萄糖代謝通路元件。Gatenby等[16]發現胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor, IGF）的刺激以及V-SRC、C-SRC和RAS的激活均可上調HIF-1的表達；此外HER2通路或PI3-AKT通路的激活也可促進HIF-1的合成[7]。PI3Ka或AKT1的活性突變所致的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信號通路活化，可以促進HIF-1的轉錄和翻譯[17]。除了癌基因突變外抑癌基因失活也參與了細胞能量代謝調節，如PTEN、LKB1、PML和TSC1/TSC2等抑癌基因的任一功能性失活都可以通過mTOR信號通路促進HIF-1的轉錄和翻譯，誘導代謝相關的基因表達[18,19]。

2.2 HIF-1與細胞代謝相關性 HIF-1所調控的基因涉及細胞能量代謝、離子代謝、腫瘤的侵襲和轉移、干細胞的穩態維持、兒茶酚胺代謝及血管的發生等諸多方面[20,21]。有研究[22]表明低氧反應中有55個相關基因上調，其中89%受HIF-1調控；119個相關基因下調，其中17%受HIF-1調控；其中所有的糖酵解酶類均被HIF-1上調。低氧反應中HIF-1介導的關鍵因子包括血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、GLUT1和GLUT3、糖酵解酶類、碳酸酐酶、乳酸脫氫酶A、單羧基轉運體4、丙酮酸脫氫酶激酶1等，涉及糖酵解、有氧呼吸、線粒體自噬等多方面細胞功能[16,18,22]。這些缺氧誘導的基因啟動子上都含有低氧反應元件（hypoxic response elements,HRE）。HRE是一個增強子，在缺氧條件下細胞核產生的HIF-1與靶基因HRE中的HIF-1結合位點結合促進轉錄，從而引起細胞對缺氧產生一系列的反應[23]。眾所周知，AKT可促進腫瘤細胞代謝改變、增強惡性程度，其調控的代謝因子包括與線粒體及凋亡抵抗相關的己糖激酶（hexokinase, HK）、糖酵解限速環節之一的6-磷酸果糖激酶1（6-phosphofructokinase 1, PFK1）以及分布最為廣泛的葡萄糖轉運體GLUT1[24]。HIF-1則可上調GLUT1和GLUT3的表達，激活HK1和HK2的轉錄，上調HK的合成[25]。

HIF-1可調節能夠將丙酮酸轉化為乳酸的乳酸脫氫酶A和將乳酸轉運出細胞的單羧酸轉運蛋白的表達[25,26]。還有研究[27]發現HIF-1也參與丙酮酸脫氫酶激酶表達的調控。丙酮酸脫氫酶激酶通過催化丙酮酸脫氫酶磷酸化使之失去活性，因此丙酮酸脫氫酶激酶的激活可以阻止丙酮酸進入線粒體，減少參與三羧酸循環的丙酮酸量，從而減少NADH和FADH2電子鏈的傳遞。這是細胞對低氧適應的主要機制之一。腫瘤細胞中HIF-1通過上調糖轉運和糖酵解酶的相關基因，促使腫瘤在低氧時采用糖酵解途徑[28]。而相關編碼蛋白和腫瘤抑制基因突變造成的HIF-1結構性表達，可使腫瘤在氧充足時仍然采用糖酵解的方式進行能量代謝[29]。

2.3 HIF-1與NSCLC的相關性研究 HIF-1在腫瘤的發生和轉移中扮演著重要角色，其基因多態性與NSCLC預后密切相關[12]。Zhong等[30]應用免疫組化方法檢測了HIF-1在多種腫瘤中的表達，發現90%的NSCLC組織中HIF-1表達升高，而癌旁組織中未見HIF-1表達。Li等[31]應用免疫組化方法檢測CCR7、HIF-1和HIF-2在94例NSCLC組織中的表達，發現CCR7、HIF-1和HIF-2的陽性表達與NSCLC臨床分期和淋巴結轉移相關；體外實驗發現缺氧可以通過誘導BE1和A549肺癌細胞的HIF-1和HIF-2表達而上調CCR7的表達；應用siRNA技術抑制A549肺癌細胞HIF-1和HIF-2表達則可以下調CCR7表達，并抑制細胞的侵襲轉移潛能。Zuo等[32]應用免疫組化SP法檢測HIF-1和VEGF-C蛋白在48例NSCLC癌組織及癌旁組織的表達，結果發現HIF-1和VEGF-C蛋白在癌組織的陽性表達率分別為70.8%（34/48）和68.8%（33/48），明顯高于癌旁組織（12.5%和16.7%，P＜0.05）；HIF-1和VEGF-C蛋白在癌組織的陽性率與TNM分期及淋巴結轉移相關。Wu等[33]應用組織化學和免疫組織化學方法檢測160例NSCLC組織和20例正常肺組織標本的血管生成擬態以及CD82/KAI1、HIF-1蛋白的表達，發現NSCLC組織中CD82/KAI1、HIF-1蛋白及血管生成擬態陽性率分別為37.5%、48.8%和36.9%，而正常肺組織分別為95.0%、0和0；HIF-1蛋白及血管生成擬態之間具有相關性，血管生成擬態與HIF-1蛋白過表達與NSCLC不良預后相關。這些研究結果提示HIF-1在NSCLC的侵襲遷移過程中扮演著重要角色，HIF-1提高NSCLC侵襲遷移潛能的機理可能與其促進NSCLC細胞有氧糖酵解相關。

2.4 HIF-1在腫瘤治療中的應用 HIF-1抑制劑類藥物總體可分為小分子HIF-1活性抑制劑及相關信號通路阻斷劑兩類。較早發現的小分子HIF-1活性抑制劑有可溶性鳥苷酸環化酶抑制劑YC-1、熱休克蛋白90抑制劑格爾德霉素、苯甲酸類似物以及缺氧性細胞毒素TX-402等。近期研究[34]還發現異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate,PEITC）能通過減少HIF-1的RNA翻譯，有效抑制HIF-1蛋白積聚，誘導其內源靶基因CAIX、GLUT1、BNIP3及VEGF發生改變。在乳腺癌中使用HIF抑制劑地高辛和吖啶黃，可有效抑制低氧中賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX）和賴氨酰氧化酶樣（lysyl oxidase-like, LOXL）的蛋白表達上調，阻礙膠原蛋白交聯，減少骨髓源性干細胞聚集，從而干擾轉移微環境形成，抑制乳腺癌細胞的肺轉移[35]。還有研究[36,37]證實脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase, PHD）是催化HIF-1降解的限速酶，使用PHD2的強效激活劑KRH102053及其結構類似物KRH102140可降解HIF-1蛋白，抑制其相關調控基因如VEGF、醛縮酶A、烯醇酶1和單羧酸轉運蛋白4等，降低多種腫瘤細胞的遷移侵襲活力。在肺癌方面近幾年也出現了大量以HIF-1為靶點的研究。多種NSCLC中發現拓撲異構酶I抑制劑拓撲替康（topotecan）及拓撲異構酶II抑制劑依托泊苷（etoposide）能夠有效抑制HIF-1蛋白表達及AKT磷酸化，且呈現時間周期依賴性[38]。在A549細胞中穿心蓮內酯可通過TGF1通路上調PHD2，使HIF-1發生快速泛素依賴性降解，下調VEGF的蛋白表達，抑制腫瘤微血管生成[39]。PX-478作為HIF-1的強效小分子抑制劑，被證實在體內及體外模型中均可抑制肺腺癌及小細胞肺癌的細胞活力，被建議納入肺癌患者I期臨床試驗[40]。還有研究[41]發現，雷帕霉素能夠通過促進HIF-1降解來抑制生存蛋白（survivin）的表達，誘導多種NSCLC細胞系發生凋亡。

基因治療方面已有多項研究證實利用RNA干擾等相關技術特異性抑制HIF-1活性，可有效抑制多種惡性腫瘤細胞活性。Kamlah等[42]研究發現，靜脈注射HIF-1-siRNA和HIF-2-siRNA可以有效延長Lewis肺癌荷瘤裸鼠的生存期，抑制腫瘤生長并減少血管生成。在宮頸癌細胞中靶向沉默HIF-1可明顯下調GLUT1和HK2的基因表達水平，降低糖酵解活性并促進細胞凋亡，抑制體內腫瘤生長[43]。此外，一些HIF-1上游調控因子也在基因治療方面受到關注。研究[44]表明酪蛋白激酶2（casein kinase 2, CK2）siRNA可通過激活p53降低缺氧環境中HIF-1的活性；靶向激活p53則能有效抑制糖酵解中C-MYC、HIF-1和GLUT的表達，降低能量代謝水平，從而特異性殺傷癌細胞[45]。

3 GLUT1與肺癌

3.1 GLUT1與腫瘤的相關性 葡萄糖轉運體蛋白在哺乳動物細胞糖代謝過程中扮演著重要的角色。葡萄糖是水溶性物質，需要借助GLUT轉運通過細胞磷脂雙分子層進入胞漿，這是葡萄糖代謝過程中第一個限速步驟。目前發現GLUT家族成員有14種，其中GLUT1、GLUT3和GLUT4與葡萄糖有較高的親和力，在正常生理條件下可高效地轉運葡萄糖。GLUT1在體內分布最廣，各組織中均存在表達[46]。在缺血、缺氧等情況下可出現組織中GLUT1異常增高。由于在惡性腫瘤細胞中常常檢測到GLUT1和GLUT3的過表達，所以有學者提出可以將GLUTl作為內源性缺氧標志物來檢測腫瘤內的缺氧情況[47]。近年來發現，GLUT1過度表達與多種腫瘤如腎癌[48]、乳腺癌[49]、直腸癌[50]有關，且與NSCLC的關系最為密切，與其腫瘤組織類型、分化程度、腫瘤體積、淋巴結轉移及患者預后均相關。

GLUT在腫瘤中的表達及功能受許多因子調控，其中癌基因和腫瘤缺氧作用最強，GLUT1的廣泛過表達可能是這兩個因素相互作用的結果?，F已知，GLUT1的表達受低氧環境和HRE/HIF復合物雙重調控，代謝抑制使GLUT1轉化為單向轉運，確保低氧誘導葡萄糖攝取增加。在癌細胞中抑制氧化磷酸化的協同作用可上調GLUT1，與此同時HIF-1也可誘導其高表達。Williams等[51]研究發現在HIF-1缺失的中國倉鼠卵巢癌異種接種物細胞和HIF-1缺失的鼠肝細胞瘤細胞中GLUT1不表達，而野生型移植物壞死區域周圍的細胞GLUT1呈過表達。在結構性表達HIF-1的腎臟透明細胞癌中，GLUT1和HIF-1調控的基因表達上調，這提示HIF-1對GLUT1的最終表達水平有決定性作用。

3.2 GLUT1與NSCLC的相關性 研究[14]表明卵巢癌和NSCLC細胞中缺氧可誘導脫氧葡萄糖（fluorodeoxyglucose, FDG）攝入量增加及GLUT1蛋白表達上調。Ai等[11]應用免疫組織化學方法檢測84例NSCLC組織中GLUT1和HIF-1蛋白的表達，發現GLUT1和HIF-1的陽性表達率分別為95.2%（80/84）和96.4%（81/84），且具有相關性。這表明GLUT1可能與NSCLC葡萄糖的攝取及糖酵解有關，HIF-1可能參與了GLUT1的上調。Younes等[52]應用抗GLUT1和抗GLUT3多克隆抗體對289例I期NSCLC組織進行免疫組織化學檢測，結果顯示GLUT1陽性率為83%（239/289），GLUT3陽性率為21%（61/289），GLUT1和GLUT3過表達與I期NSCLC較差生存期相關，GLUT1陽性可作為NSCLC惡性侵襲的標記物。Sasaki等[53]發現GLUT1在NSCLC組織中的表達與KRAS基因突變有關，GLUT1蛋白的過表達與NSCLC的侵襲表型相關，GLUT1陽性的NSCLC患者預后明顯差于GLUT1正常表達者。Kaira等[54]對147例原發性NSCLC組織進行免疫組織化學檢測，發現GLUT1和HIF-1在未分化原發性NSCLC中的表達明顯高于高分化組和低分化組。上述研究表明GLUT1的表達與NSCLC細胞的惡性增殖和侵襲轉移性能密切相關，侵襲性強、生長旺盛的NSCLC細胞常伴有葡萄糖代謝增加。

3.3 GLUT1在腫瘤診斷及治療中的應用 如今GLUT1已被普遍認為是細胞惡性病變的早期標志，可用作早期癌前病變的診斷依據。大量研究[55]表明GLUT1的高表達與癌前病變發展無相關性，但與腫瘤進展、分化以及患者預后及生存率存在一定關聯。在相關腫瘤治療方面，研究普遍認為利用GLUT1腫瘤高表達的特點，一方面可應用化療藥物結合葡萄糖，通過GLUT1高效轉運來提高藥物攝取效率，達到對腫瘤細胞的有效殺傷；另一方面也可通過直接阻斷GLUT1在腫瘤細胞中的表達，降低細胞的能量代謝效率而發揮抑癌功效。Subbarayan等[56]發現，一氧化氮可通過與氧基團結合形成亞硝基蛋白，損傷DNA，而目前獲得的亞硝基乙酰青霉胺（S-nitroso-N-acetyl-penicillamine, SNAP）并不能直接靶向腫瘤細胞，但如將其與葡萄糖結合形成2-gluSNAP復合物，則能大大提高其殺傷腫瘤細胞的能力。在GLUT1相關分子抑制劑探索方面，Wardell等[57]發現使用組蛋白脫乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitors, HDACIs）可靶向抑制骨髓瘤細胞中GLUT1介導的葡萄糖轉運，通過改變碳源攝取途徑建立不利于腫瘤細胞快速生長存活的能量代謝模式提高療效。Cao等[58]研究表明，聯合GLUT抑制劑根皮素和化療藥物柔毛霉素可有效提高癌細胞的化療敏感度，降低抗藥性。Lemoine等[59]應用泛脫乙?；福╬andeacetylase, DAC）抑制劑LBH589作用霍杰金淋巴瘤細胞系，發現其能夠通過下調HIF-1及下游靶基因GLUT1與VEGF的表達以有效殺傷癌細胞，有望將LBH589聯合mTOR抑制劑治療此類腫瘤患者；同時LBH589也可參與矯正GLUT1相關的FDG-PET臨床影像診斷。

在基因治療方面較多研究選擇以GLUT1上游轉錄因子作為靶點進行干預。有研究[60]表明應用siRNA技術沉默U251、U87和U373神經膠質瘤細胞的HIF-1后，GLUT1和VEGF蛋白表達水平明顯下降；相應裸鼠體內實驗中siRNA治療組比對照組的腫瘤體積減小了約50%。

4 問題與展望

腫瘤生長不一致可導致腫瘤血管功能和結構異常，致使腫瘤組織中出現區域性急性缺氧和慢性缺氧，引起腫瘤細胞的基因及蛋白質表達發生改變，發生細胞生長受限和死亡；同時，低氧也可誘導新生血管、增強糖酵解、抑制凋亡、激活生長因子。葡萄糖的攝取和糖酵解的增強造成腫瘤細胞惡性轉化、侵襲轉移和對放化療等治療的抵抗，使目前的治療方法難以達到理想的效果，為腫瘤的治療帶來了難題，也提供了新的切入點。目前FDG-PET顯像、氧電極應用和腫瘤內源性缺氧標志物的檢測已經為腫瘤的早期診斷、治療前后效果的評估和預后的判斷提供了新的方法。然而，盡管有氧糖酵解是腫瘤最明顯的能量代謝特征，仍存在一部分腫瘤細胞無法用FDG-PET成像即“PET陰性”腫瘤。是否此類腫瘤細胞并非依賴糖代謝，而是依靠其它形式的生物能量還有待探索。目前HIF-1和GLUT1對糖酵解的調控機制尚不完全清楚，但隨著對HIF-1和GLUT1與NSCLC相關研究的深入，HIF-1和GLUT1有望成為NSCLC治療的新靶點。